Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
взятого фермента. Следовательно, количество ингибитора, связанного
ферментом, всегда будет составлять лишь незначительную долю всего
количества
Ингибирование и активация ферментов
519
et, нМ
Рис. 8.8. Теоретические| графики зависимости начальной скорости от
суммарной концентрации фермента (et) в отсутствие ингибитора и при
различных концентрациях прочно связывающегося ингибитора [3257].
Приведены данные-для двухсубстратного фермента, функционирующего по
механизму (8.69). АГмА= 1,5 мкМ; /GA=0,5 мкМ; /Смв=5 мкМ; V=10 мкМ/мин на
1 нмоль фермента; а=100 мкМ; 6 = 30 мкМ; /Сг= 0,01 нМ. Суммарные
концентрации ингибитора (в нМ) указаны около каждой кривой. Пунктирные
прямые -
асимптоты, полученные расчетным путем (в присутствии ингибитора).
ингибитора, и в этих условиях концентрацию свободного ингибитора можно
считать равной его полной концентрации. Из этого же допущения (аналогично
допущению, которое обычно делают для концентрации субстрата при изучении
кинетики действия ферментов) мы исходили и при выводе уравнений
ингибирования.
В то же время ряд ингибиторов, например ингибиторы окислительного
фосфорилирования рутамицин и бонгкрековая кислота [1899], антитела к
специфическим ферментам [2436], аналоги переходного состояния [5136] и
мощные ингибиторы холин-эстераз [3309], имеют Ki порядка 10~9 М или
меньше, так что молярности ингибитора и фермента могут быть величинами
одного порядка. В этом случае связывание ингибитора ферментом может
значительно уменьшить концентрацию свободного ингибитора, так что в
уравнения, при выводе которых концентрация свободного ингибитора
принималась равной его полной концентрации, придется ввести поправку.
Детально проанализировав влияние прочно связывающихся ингибиторов,
Голдштейн [1605] показал, что при et/Ki^0,001, где et - полная
концентрация: фермента) положения теории Михаэлиса оказываются
неприменимыми. Моррисон [3257] рассмотрел теоретические кривые,
иллюстрирующие влияние концентрации фермента на начальную скорость
реакции в присутствии различных количеств прочно связывающегося
ингибитора; эти кривые приведены на рис. 8.8.
Кривые такого типа обсуждались ранее, и по виду графиков зависимости v от
et в присутствии и в отсутствие ингибитора можно судить о наличии в
системе прочно связывающегося:
520
Глава 8
ингибитора. Асимптота кривой пересекает ось et в точке, соответствующей
числу связанных молекул ингибитора. Следовательно, в условиях, при
которых связывается практически весь ингибитор, этот подход может быть
использован для определения концентрации связывающих участков фермента.
Однако точность такого определения зависит от соотношения между
концентрацией фермента и величиной Ki- Как видно из рис. 8.8, наклон
кривой при более высоких концентрациях Е и I отличается от наклона
асимптоты, поскольку концентрация свободного ингибитора становится
существенной.
Моррисон вывел также общее уравнение, описывающее влияние прочно
связывающегося ингибитора на начальную скорость ферментативной реакции.
Запишем уравнение скорости ферментативной реакции в виде
где в N входят константы скорости и концентрации субстратов, которые
определяют V, а величина D в знаменателе является суммой членов,
отражающих распределение фермента между разными его формами (свободным
ферментом и его комплексами) [4922]. Тогда мы получим общее кинетическое
уравнение, которое применимо при любом механизме, независимо от его
сложности и числа участвующих в реакции субстратов. При наличии в системе
ингибитора знаменатель уравнения (8.85) будет иметь в общем случае вид D
+ Ni(i/Ki), а если ингибитор связывается не с одной, а с несколькими
формами фермента, то D + rZNi/Ki. Уравнение скорости при наличии прочно
связывающегося ингибитора может быть выражено через полные концентрации
ингибитора и фермента (// и et) следующим образом:
откуда
(8.86)
В Ni входят концентрация ингибитора и константы скорости, которые
определяют долю фермента, находящегося в составе фер-мент-ингибиторного
комплекса. Это уравнение было использо-
Ингибирование и активация ферментов
521
А
к
Б
к, = пм им
1,2
0,8
0,4
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
- (мкМ~') а '
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
- (мкМ~') а
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
мкМ~')
Рис. 8.9. Теоретические графики двойных обратных величин для систем с
прочно связывающимся ингибитором; концентрация фермента 1 нМ [3257].
Числа у кривых - значения константы Ki¦ Рассматривается та же система,
что и на рис. 8.8. А. Конкурентное ингибирование. Б. Смешанное
ингибирование. В. Бесконкурентное ингибирование.
вано Моррисоном в качестве основы для вывода уравнений, описывающих
влияние прочно связывающихся ингибиторов в системах с различными
кинетическими механизмами. Он показал, что графики зависимости обратной
скорости от обратной концентрации субстрата могут существенно отклоняться
от прямой при наличии в системе прочно связывающегося ингибитора (см.
рис. 8.9). .
Гендерсон [1899], используя общее уравнение Моррисона, получил уравнение
