Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
скорости односубстратной реакции в присутствии ингибитора:
где Vi и Vo - начальные скорости в присутствии и в отсутствие ингибитора,
i - концентрация свободного ингибитора. Это общее уравнение применимо ко
всем односубстратным системам независимо, от механизма ингибирования при
условии, что с ферментом (с любым из его центров) связывается только одна
молекула ингибитора.
Используя соотношение
(8.87)
;4=2(Е1Ж,
(8.88)
уравнение (8.87) можно преобразовать к виду
(8.89)
9-14
522
Глава 8
Таблица 8.4
Кинетические уравнения для прочно связывающихся ингибиторов
Ингибирование
"</*1
Кинетическое уравнение
Конкурентное
Неконкурентное
Смешанное
Бесконкурентное
Км/Ki
(s+*m)/*i
K'i т Ki
s/Kt
Vi
Vo
¦ = e + K
I s + К{л \ v0
4 ) Vi
Vo
1-^-
¦e+\
Km s + Km.
Km
Vo
Vo
Ki 4- K'i s + Km \ va
Видно, что график зависимости it/(I-Vi/vо) от v0/vi является линейным и
позволяет определить et, или, точнее, концентрацию связывающих участков
фермента непосредственно по длине отсекаемого отрезка.
Выражения для Ni/Ki, которые аналогичны рассмотренным выше (с. 484-497),
можно подставить в (8.89); в табл. 8.4 приведены эти выражения и полные
кинетические уравнения для различных типов ингибирования.
Легко видеть, что характер семейств прямых, получаемых при построении
графиков зависимости it/( 1-и,/ио) от ОоМ Для разных концентраций s,
будет указывать на тип ингибирования. В случае конкурентного
ингибирования получают семейство прямых, которые проходят через общую
точку et на оси ординат, причем их наклон увеличивается при увеличении s.
Бесконкурентному ингибированию отвечает аналогичное семейство прямых, но
наклон их уменьшается при увеличении s. При неконкурентном ингибировании
наклон получаемой прямой не зависит от s. Примеры таких графиков и
вторичных графиков зависимости наклонов прямых от s приведены на рис.
8.10. Преимущество метода состоит в том, что графики являются линейными.
Был проведен детальный статистический анализ систем, подчиняющихся
уравнению (8.89), и опубликованы программы
Ингибирование и активация ферментов
523
В
О 1,0 2,0 3,0
щ/щ
......................
0 2 4 6 8
"о/Ц
О 200 400 600 800
s
Рис. 8.10. Анализ действия прочно связывающегося ингибитора по методу
Ген-дерсона [1899]. Графики построены по соответствующим уравнениям,
приведенным в табл. 8.4, для простых односубстратных систем. При расчете
использованы следующие значения приведенных ниже величин: Хм=100,.
е<=0,1, Аг=0,1. Концентрация ингибитора (it) изменялась от 0,025 до 1,0,
фиксированные концентрации субстрата составляли 25, 50, 100, 200, 400,
800. А. Конкурентное] ингибирование. Б. Бесконкурентное ингибирование. В.
Вторичные графики зависимости наклонов прямых на графиках А и Б от s для
конкурентного (¦), бесконкурентного (А) и неконкурентного (#)
ингибирования.
для ЭВМ, позволяющие оценить стандартные ошибки определяемых кинетических
параметров [1900].
В случае ингибирования смешанного типа характер изменения наклонов
графиков зависимости it( 1-Vi/vо) от УоМ при изменении концентрации
субстрата зависит от относительных значений Kt и K'i. Вторичные графики
зависимости наклонов ¦от s или от 1/s не являются линейными; однако обе
ингибиторные константы можно определить путем экстраполяции линейных
участков полученных кривых, поскольку при s-уоо величиной Км/Ki можно
пренебречь, и мы получим соотношение
При s-у0 можно пренебречь величиной s/K'i, и тогда мы будем иметь
(8.90)
524
Глава 8
(8.91)
Гендерсон отметил, что общее уравнение
(8.92)
применимо и в тех случаях, когда имеет место взаимодействие прочно
связывающихся ингибиторов не с одним, а с несколькими центрами фермента.
Диксон [1114] предложил графический метод анализа систем с конкурентным и
неконкурентным ингибированием, который сходен с его же методом,
разработанным для кинетических систем с прочно связывающимися субстратами
(см. гл. 4). Рассматривается график зависимости v от г, который
представляет собой кривую, начинающуюся из точки v0 при i=0 и спадающую
при увеличении i. Исходная скорость (по) не обязательно должна быть
максимальной (У)-можно пользоваться и графиком ингибирования, полученным
при ненасыщающей концентрации субстрата.
Для конкурентного ингибирования, осуществляющегося в соответствии с
уравнением (8.1) в равновесных условиях, обозначим концентрацию комплекса
ES через х, концентрацию комплекса EI - через у, концентрацию свободного
фермента - через ef\
График зависимости v от i имеет вид, представленный на рис. 8.11,Л.
Выберем на кривой точку, соответствующую такому п, что
v=k+2x, V=k+2et
et*=ef+x+y,
it = i-\~ У,
V
(8.93)
(8.94)
(8.95)
(8.96)
V° 1 + /См/s •
Решая эти уравнения обычным путем, получим
(8.97)
п п (1 + /Cm/s)
(8.98)
Ингибирование и активация ферментов
525
Рис. 8.11. Графическое определение Ki для ингибитора с сильным сродством
по методу Диксона [1114]. А. По оси ординат отложена скорость
ферментативной реакции, по оси абсцисс - суммарная концентрация
