Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
ингибитора. Для неконкурентного ингибитора K=Kt, для конкурентного
ингибитора Ki можно определить из зависимости К. от s, как показано на
рис. Б.
V п - 1
--к>
S п | 1
КШ Vq li ; 2
(8.99)
Для этой точки
н' н*
V-"'(1 + -TL) ''('-IT
где i't равно it в точке п.
Если провести прямую из точки Vo через точку-, то горизонтальную ось она
пересечет в точке in, откуда из геометрических соображений получим
(8.100) (8.101)
и, следовательно,
I|J"( п- 1 )1'
^"Кчк-1+е'=пК'{1+^)+'-
Таким образом, расстояния между точками на горизонтальной оси,
полученными при пересечении ее семейством прямых, для которых п
отличается на единицу (т. е. проведенными через точки кривой о0/2, Оо/З,
Оо/4 и т. д.), будут одинаковыми. Это расстояние (обозначим его через К)
равно
(8.102)
Следовательно, если Км. известно, легко найти Kt. Вследствие
526
Глава 8
"конкурентного" действия субстрата величина К, конечно, зависит от его
концентрации, и если Км неизвестна, то, определив К при разных
концентрациях субстрата и отложив ее в зависимости от s, мы получим
прямую, которая пересекает оси в точках Ki и Км. (рис. 8.11,5).
Для определения концентрации фермента через точки на кривой,
соответствующие v = v0/2, оо/З и т. д., и точку v0 следует провести
прямые, затем из абсциссы точки пересечения г2 вычесть К и найти точку с
абсциссой м, через которую проходит касательная к начальной части графика
(рис. 8.11); далее нужно вычесть К из абсциссы i'i и найти тем самым
искомую концентрацию е.
Для систем с неконкурентными ингибиторами, описываемых (8.17), уравнение
ингибирования имеет вид
Это уравнение аналогично (8.97), но вместо s/Км в него входит s/(Km+s).
Анализ ингибирования по методу, рассмотренному выше для конкурентного
ингибирования, приводит к уравнению
Таким образом, в данном случае Кг определяется непосредственно из
графика.
Диксон показал, как с помощью данного метода можно прямым путем
определить концентрации всех присутствующих в системе компонентов (см.
рис. 8.12). При анализе конкурентного ингибирования для этого нужно
провести прямые из точки г'о через точки v0 и Vmax и определить
концентрации реактантов так, как это показано на рисунке. В случае
неконкурентного ингибирования, поскольку
н
(8.103)
(8.104)
Подставляя
V __ Km + s
(8.105)
v0 s
получаем
in=nKt+et,
(8.106)
откуда
К - in i,i-i -Ki-
(8.107)
У _____ ej ^м Углах Vp
(8.108)
г х s
(где z - концентрация комплекса ESI), следует провести еще
Ингибирование и активация ферментов___________________527
л Б
Рис. 8.12. Метод определения концентраций компонентов в различных точках
графика зависимости скорости от концентрации ингибитора [1114]. Приведена
часть рис. 8.11, А в увеличенном масштабе. А. Конкурентное ингибирование^
Б. Неконкурентное ингибирование.
одну прямую из точки Vo, параллельную прямой, соединяющей Vmax и io, и по
графику определить все шесть концентраций.
Метод Диксона имеет ряд преимуществ. Он весьма прост и не требует много
времени: необходимо провести лишь несколько прямых на обычном графике
зависимости v от i. Никакие математические выкладки [уравнения (8.93) -
(8.102)] при определении искомых величин не используются. Метод
достаточно универсален, поскольку он в равной мере применим в случаях как
"обычных", так и прочно связывающихся ингибиторов; таким образом, он
позволяет избежать ошибок, связанных с предположением, согласно которому
i=i*. Наконец, с помощью этого метода можно определить концентрации
различных форм фермента в любой точке кривой ингибирования, если
ингибитор
528
Глава 8
является прочно связывающимся. Если же он не является таковым, то точка
iо приближается к нулю; это показывает, что концентрации форм фермента
пренебрежимо малы по сравнению с концентрацией ингибитора. Не следует,
однако, думать, что с помощью этого метода (как и других графических
методов) можно получить столь же точные данные, как и при использовании
более сложных статистических методов. Подобно всем графическим методам,
метод Диксона нельзя применять для анализа систем с очень сложной
кинетикой, которые трудно охарактеризовать такими параметрами, как Дм или
Дг-.
ВЛИЯНИЕ pH НА ИНГИБИРОВАНИЕ
Характер ингибирования ферментов может заметно изменяться в зависимости
от pH; в случае необратимого ингибирования эти изменения бывают иногда
выражены не менее сильно, чем в случае обратимого ингибирования. При
необратимом ингибировании скорость взаимодействия ингибитора с ферментом
может зависеть от pH либо потому, что различные ионные формы фермента
реагируют с ингибитором с разными скоростями, либо потому, что сам
ингибитор подвергается ионизации. Количественный анализ в этом случае
может быть проведен таким же путем, как и при выяснении влияния pH на k+2
[уравнение (4.254) и последующие] .
В случае обратимого ингибирования влияние pH может проявляться по-разному
в зависимости от механизма действия самого ингибитора. Если ингибитор
действует, уменьшая V, то pH может влиять на ингибирование либо через
