Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
Эти уравнения для равновесных и для стационарных условий выведены с
помощью методов, аналогичных рассмотренным выше. Их следует сопоставить с
уравнениями для более простых механизмов, которые рассмотрены на с. 483-
497. Для всех систем, приведенных в табл. 8.3, величины Ks, Км и V равны
k-i/fe+i, (k-i + k+2) /k+i и k+2e соответственно, а Ki и K'i равны &-
3/&+3 и &-4/1&+4 соответственно.
Отметим, что во все уравнения входят члены, содержащие i2, а величина s
входит в эти уравнения (кроме случая "неконкурентно-конкурентного"
механизма в стационарных условиях) только в первой степени.
Следовательно, графики зависимости l/v от 1/s будут линейными, а графики
зависимости от i- параболическими. Например, для конкурентного
ингибирования
Кинетические уравнения для ферментных систем, в которых могут
образовываться комплексы вида EI
Ингибирование и активация ферментов
517
наклон графика зависимости l/v от i будет равен
Наклон=-Щ- -j-(l + i, (8.82)
т. е. он будет увеличиваться быстрее, чем г. В этих случаях, как. и при
частичном ингибировании, обычные графики двойных обратных величин для
ряда фиксированных концентраций i являются линейными, поэтому для
обнаружения отклонений от простых механизмов необходимо строить графики
зависимости от г.
Графики, характеризующие действие ингибитора, не являются линейными и при
неконкурентном (или смешанном) ингибировании в стационарных условиях; как
обсуждалось выше (с.
490-491), в этом случае как г, так и s входят в кинетическое уравнение во
второй степени, и, следовательно, графики двойных обратных величин и
вторичные графики зависимости наклонов от г, а также графики зависимости
l/v от i не будут линейными (отклоняются вверх).
Для механизмов, в которых с разными промежуточными формами фермента
связываются две или более молекул ингибитора, графики двойных обратных
величин остаются линейными; например, для механизма
*+is
ES > Е + Р (8.83)
EI ESI
уравнение скорости в стационарных условиях имеет вид
А'м
"=-----------к.. Г V ¦ '---------f-- (8-84)
1 + -
(1 + xr)
Kt'
Оно получено в результате простого сложения эффектов, к которым приводит
наличие в системе конкурентного и бесконкурентного ингибиторов [уравнения
(8.6) и (8.46)]. Графики двойных обратных величин при ряде фиксированных
концентраций i будут характерными для смешанного ингибирования.
Исходя из всего сказанного, можно сформулировать ряд общих принципов
анализа данных по ингибированию.
1. Если с ферментом связывается только одна молекула ингибитора, то
график Лайнуивера - Бэрка и график зависимости l/v от i будут линейными,
за исключением систем с частичным ингибированием или неупорядоченным
связыванием ингибитора и субстрата с ферментом в стационарных условиях.
Примерами последнего случая могут служить неконкурентное и смешанное
518
Глава 8
ингибирование с неупорядоченным связыванием реактантов с ферментом. В
таких системах для стационарных условий получают уравнение, в которое
входят как i2, так и s2 и, следовательно, график двойных обратных величин
и график зависимости l/v от i могут оказаться нелинейными (см. также с.
625- 642).
2. Если имеет место частичное ингибирование, т. е. если при связывании
ингибитора образуется форма фермента, частично сохраняющая свою
активность, то график двойных обратных величин будет линейным, но график
зависимости I/о от i будет отклоняться от линейности вниз, за исключением
случая частичного бесконкурентного ингибирования (8.50), когда картина
является более сложной (с. 503).
3. Если с одной и той же формой фермента связывается более одной молекулы
ингибитора, графики двойных обратных величин будут линейными, а графики
зависимости 1/у от i - параболическими.
4. Если ни одна из отдельно взятых форм фермента не может связать более
одной молекулы ингибитора, графики двойных обратных величин и зависимости
l/v от i будут линейными, и наблюдаемое ингибирование будет отражать
простое "сложение" отдельных типов ингибирования.
НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ИНГИБИРОВАНИЯ
На активность фермента сильное влияние могут оказывать такие условия
среды, как pH и ионная сила (см. гл. 4). В то время как возможное
изменение pH среды при добавлении ингибитора обычно строго
контролируется, на изменения ионной силы часто не обращают внимания.
Следует, однако, иметь в виду, что в отличие от специфического обратимого
ингибирования, наблюдаемое при увеличении ионной силы ингибирование
обычно не характеризуется простой зависимостью от "концентрации"
ингибитора; поэтому, сделав измерения при разных концентрациях
ингибитора, можно показать, что величина Ki в действительности не
является постоянной. Другой подход состоит в проведении исследований при
достаточно высокой ионной силе; при этом изменения ионной силы,
вызываемые добавлением ингибитора, оказываются незначительными.
ИНГИБИТОРЫ С ОЧЕНЬ ВЫСОКИМ СРОДСТВОМ
Для получения заметного эффекта ингибирования количество ингибитора в
большинстве случаев должно быть очень большим по сравнению с количеством
