Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
предельной скорости,
Ингибирование и активация ферментов
50 Г
которая определяется скоростью распада комплекса EIS (см. табл. 8.2).
Корниш-Боуден [885] показал, что, если метод Диксона не позволяет найти
кинетические константы, можно воспользоваться графиком зависимости s/v от
?. В случае смешанного ингибирования уравнение (8.63) можно преобразовать
к виду
-f=-^- (1+ JL (1 + М') (8.64)
и, следовательно, график зависимости s/v от ? будет линейным; прямые,
полученные для двух разных концентраций субстрата, пересекутся в точке,
лежащей либо выше, либо ниже оси ?, с абсциссой - K'i. Ордината точки
пересечения равна (1-Ki/K'i)l /V; эта точка будет лежать выше оси ? при
Ki>K'i и ниже этой оси при Ki<K'i. Преобразуя соответствующим образом
уравнение (8.46), получим
-Н^ + -И1+№. (8-65)
Следовательно, при бесконкурентном ингибировании прямые пересекаются над
осью ?, а абсцисса точки пересечения равна -Ki. Преобразуя аналогичным
образом уравнение (8.58) для случая конкурентного ингибирования, найдем,
что прямые, по-
Конкурентное
Неконкурентное
Бесконкурентное
I
Смешанное
-Ki
Рис. 8.5. Графическое определение ингибиторных констант (метод Корниш-
Боудена). Во всех случаях si>S2.
8"
•508
Глава 8
лученные при разных концентрациях субстрата, будут параллельными и,
следовательно, данным методом нельзя определить Ki.
Графики, получаемые этим методом, приведены на рис. 8.5; .используя его
наряду с методом Диксона, можно однозначно установить тип ингибирования,
а также определить значения всех ингибиторных констант.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНГИБИТОРНЫХ КОНСТАНТ ДЛЯ СИСТЕМ С ЧАСТИЧНЫМ ИНГИБИРОВАНИЕМ
Как мы уже говорили, при частичном ингибировании наблюдаются
гиперболические кривые, поскольку с увеличением концентрации ингибитора
скорость снижается до некой предельной величины. Однако для определения
Ki можно прибегнуть к преобразованиям, позволяющим получать линейные
графики. Например, в случае частичного конкурентного ингибирования наклон
графиков зависимости 1/у от 1/s по данным табл. 8.1 [см. также уравнение
(8.15)] определяется следующим выражением:
KsO + i/Kj) _ Ks (1 + i/Kj)
Наклон=¦
V(l+iKsIKiKs') V(1 + i/Ki')
(8.66)
Следовательно, график зависимости наклона от i будет равнобочной
гиперболой, как показано на рис. 8.6, Б; отметим, что при i=0 наклон
кривой равен KsJV. Эту кривую можно превратить в равнобочную гиперболу,
которая проходит через начало координат, используя величину, равную
изменению наклона •(Анакл). Эта величина определяется как
"накл-у (! + ?//(,')¦
Ks _ KsiIKi-KsHKi' У V + Vi/Ki'
(8.67)
Увеличение i
•Рис. -8.6. Графический анализ частичного конкурентного ингибирования.
Ингибирование и активация ферментов
509
Преобразуя выражение (8.67), получим
1 /а _ VKt'Ki 1 I VKt /о cm
7 накл- K,(Ki'-Kt) ¦ i 'Г Ks(Ki'-Ki) ¦ ^•DO;
Следовательно, график зависимости 1/Анакл от 1/i является прямой, которая
пересекает ось 1/i в точке с абсциссой, равной -1 IK'i (рис. 8.6,В).
Таким же путем можно линеаризовать зависимости наклонов и длин отрезков
от концентрации ингибитора и в других случаях частичного ингибирования
(см. табл. 8.2).
ИНГИБИРОВАНИЕ В ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМАХ С НЕСКОЛЬКИМИ СУБСТРАТАМИ
Типы ингибирования, которые могут наблюдаться для ферментативных реакций
с участием нескольких субстратов, подробно рассматривались в гл. 4.
Уравнения начальной скорости для таких систем весьма сложны, и хотя
данное соединение может вызывать ингибирование определенного типа в
отношении одного из субстратов, в целом механизм ингибирования может быть
более сложным, поэтому ингибирование бесконкурентного и смешанного типов
в полисубстратных системах наблюдается гораздо чаще, чем в
односубстратных системах.
При этом оказываются более сложными и способы определения Ki. Рассмотрим,
например, двухсубстратную реакцию, подчиняющуюся уравнению (4.86),
ингибитор которой является конкурентным по отношению к субстрату А.
Уравнение скорости будет иметь вид
Vsa 17К 7в КАКВ * (8.69)
Дм -^М
1 + -J- (1 + i/Ki) +~т~ + -^Г- (1 + */*!>
В этом случае наклон графиков зависимости I/о от 1/а определяется
выражением
(*& + *,А/С" (! + (/*,)
и, следовательно, вторичные графики зависимости этого наклона от i будут
прямыми, которые пересекают ось абсцисс в точке -Ki. Однако такое простое
соотношение не будет выполняться в том случае, когда величина Ki,
входящая в (8.69) совместно с КАм, отличается от той, которая входит в
это выражение совместно с KAsKBм. Из уравнения (8.69) следует, что по
отношению к субстрату В будет наблюдаться ингибирование смешан-
510
Глава 8
ного типа; наклон графика двойных обратных величин определяется
выражением
а длина отрезка, отсекфмого от оси ординат, равна
Следовательно, вторичные графики зависимости наклонов от i будут
пересекать ось абсцисс в точке -(Н-a/KAs)K'i, а вторичные графики
зависимости длин отрезков от i - в точке -(1 + + a/KAn)Ki. Если Ki и K'i,
входящие в приведенные выражения, различаются и a, KAs и КмА известны, то
