Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
течение 6 ч налейте на чашку 5 мл среды для разведения фага Xи
инкубируйте при 5°С в течение 2-12 ч. Если позволит время, то, используя
быстрый метод, выделите ДНК из этих препаратов фага.
9. Гибридизация бляшек
49
Определение длин рестрикционных фрагментов ДНК гибридных фагов X
9. Расщепите по 5 мкл каждой ДНК рестриктазами EcoRI и Hind III и
нанесите на гель 0,7%-ной агарозы. Проводите электрофорез в течение 6 ч
при 50 В. Остатки тех препаратов фага, из которых быстрым методом были
выделены ДНК, сохраните, чтобы вырастить фаг на чашках в большом
количестве.
Препараты с чашек
10. Приготовьте по 20 чашек каждого из трех -шести фагов, выбранных на
основании результатов электрофореза в геле. Выращивайте в течение 6 ч.
Налейте на чашки по 5 мл среды для разведения фага X при 5°С.
Сбор фага с чашек
11. Следуйте методике 2 выделения фага X вплоть до стадии
центрифугирования. Используйте минимальное число пробирок. Препарат с 20
чашек можно уместить в две центрифужные пробирки объемом 45 мл.
Очистка фага в растворе CsCl
12. Ресуспендируйте осажденный фаг в суммарном объеме 1 мл (по 0,5 мл на
каждую из двух пробирок). Следуйте методике 4-IA очистки в ступенчатом
градиенте.
13. Продолжайте очистку фага.
Обсуждение
Ник-трансляция - процедура довольно длительная, и начинать ее следует как
можно раньше. Обязательно наденьте фартук для работы с радиоактивностью,
халат, защитные очки и двойные перчатки. Пользуясь ручным счетчиком,
постоянно проверяйте, нет ли загрязнения радиоактивностью (см. методику
22). Необходимо заранее запастись 32Р-СТР или другим меченным 32Р
дезоксирибонуклеозидтрифосфатом, ДНКазой I, дезо-
ксирибонуклеозидтрифосфатами, а также буфером 10XNT, останавливающим
раствором и буфером ТЕ.
50
Раздел I. Эксперименты
Эксперимент 10
Гибридизация из гедя (блот-гибридизация)
Введение
Проведя гибридизацию рестрикционных фрагментов, полученных прямо из
клеток 5. typhimurium дикого типа и различных делеционных мутантов, можно
выявить, какие из них гомологичны специфической ДНК-зонду. С помощью
такой гибридизации можно определить как приблизительный порядок этих
делеций на карте, так и положение их концов.
Обоснование и план эксперимента
Выделяют ДНК из различных штаммов Salmonella. Выделяют ее прямо из
колоний, используя методику быстрого выделения ДНК- Затем выделенную ДНК
расщепляют разными рестрикционными эндонуклеазами, проводят электрофорез
в агарозном геле и разделенные фрагменты переносят на нитроцеллюлозу.
После этого проводят гибридизацию таких полосок нитроцеллюлозы с ДНК,
меченной 32Р с помощью ник-трансляции. С этими полосками экспонируют
рентгеновскую пленку. После того как пленка проявлена, можно определить
размеры тех рестрикционных фрагментов, которые гомологичны использованной
ДНК-зонду.
Методика '
Быстрое выделение ДНК
1. Прямо из колоний штаммов, полученных в эксперименте 5, выделите ДНК.
Можно выделять ДНК также и из небольших жидких культур объемом 1 мл. При
выделении ДНК из колоний следуйте методике 12-II. Ресуспендируйте ДНК в
50 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис (pH 7,5), 10~4 М Ыа2-ЭДТА, 10
мкг/мл РНКазы.
Расщепление рестрикционной эндонуклеазой
2. Расщепите 10 мкл полученной выше ДНК рестриктазой ?coRI, 10 мкл
рестриктазой HindiII и' 10 мкл совместно рестрикта-зами ?coRI и BamHl или
?coRI и Hindlll, или HindiII и BamHl.
Электрофорез в геле
3. Каждую пробу расщепленной ДНК нанесите целиком в одну ячейку геля
0,7%-ной агарозы. Пользуйтесь грпс-ацетатным
П. Электронная микроскопия ДНК
51
буфером. Проводите электрофорез в течение ночи (при 20 В в течение 18 ч
или при 30 В в течение 12 ч).
Используя методику 21-1, перенесите ДНК из геля на нитроцеллюлозу.
Перенос проводите в течение ночи.
Гибридизация с набором рестрикционных фрагментов
4. Снимите полоску нитроцеллюлозы с геля, промойте и проведите отжиг.
Поместите его в герметизируемый мешочек и добавьте зонд, как описано в
методике 23.
После гибридизации в течение по крайней мере 24 ч выньте полоску
нитроцеллюлозы, на которую был перенесен материал из геля, из мешочка, в
котором проводилась гибридизация. Промойте ее, промокните досуха,
оберните в пластиковую пленку и экспонируйте с рентгеновской пленкой.
Проявите пленку. Напишите на ней полное время экспозиции. Если экспозиция
оказалась недостаточной, то заложите новую пленку.
Эксперимент И
Электронная микроскопия ДНК
Введение
Вопреки распространенному мнению электронная микроскопия ДНК представляет
собой простую, быструю и надежную методику. При этом изучаются
индивидуальные молекулы ДНК и можно увидеть все молекулы, так что этот
метод очень хорошо дополняет метод электрофореза в геле. При
электрофорезе в геле выявляются лишь популяции молекул с одинаковыми
размерами. Помимо обычной визуализации ДНК можно, исследуя
гетеродуплексы, проводить картирование негомологичных областей.
Обоснование и план эксперимента
Сначала, визуализируют ДНК, используя водную методику и окрашивание
