Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
10. Это можно сделать, нанеся капли культур на селективную чашку (NCE +
лактоза). На одно место чашки нанесите каплю культуры реципиента, на
другое - каплю культуры донора, а на третье - капли и той и другой
культуры. После того как жидкость впитается, штрихом рассейте материал
каждого пятна по своему сектору чашки. Это делается для того, чтобы из
конъюгационной смеси получить от-
13. Встраивание F'tslac+, направляемое Тп 10
55
дельные колонии эксконъюгантов, а не просто зоны сплошного роста на месте
нанесения капель. Инкубируйте чашки в течение 36-48 ч при 30°С.
3. Из пятна конъюгации отберите уколом несколько больших колоний. (В
контрольных пятнах колоний быть не должно). Это и есть реципиенты,
получившие плазмиду F^s /ас+. Каждую из этих колоний рассейте штрихом на
двух минимальных чашках NCE с лактозой. Одну чашку инкубируйте при 40°С,
а другую - при 30°С.
4. Через 48 ч должен вырасти штрих на чашке, инкубируемой при 30°С. На
той чашке, которая инкубировалась при 40°С, на месте штриха должно быть
лишь несколько больших колоний. Это и есть искомые Hfr-клетки. Они
являются ЬасФ при той температуре (40°С), при которой невозможна
автономная репликация эписомы F^'s 1ас+. Как предполагается, гены iac+
эписомы F', встроившись в хромосому, перестали быть чувствительными к
температуре. Уколом отберите несколько таких предположительных Hfr-клеток
и вырастите их культуры в жидкой селективной среде (NCE + 0,5% лактозы)
при 40°С. Также посейте в LB (при 37°С) культуры ряда реципиентов,
которые будут использоваться для картирования. Это единичные ауксотрофы,
каждый из которых несет также мутацию устойчивости к стрептомицину. Нужно
немного таких штаммов. Поэтому можно рискнуть и приготовить один набор
реципиентных культур сразу на несколько групп. Чтобы сэкономить чашки,
можно и контрольные чашки с реципиентами приготовить сразу на несколько
групп.
5. Для картирования точек начал переноса Hfr-штаммов проведите
скрещивания на чашках. В первых скрещиваниях штаммы донора и реципиента
(по 0,1 мл каждого) высевайте прямо на селективную среду (Е -F
стрептомицин). Инкубируйте чашки при 37°С.
6. Подсчитайте число рекомбинатов. Учитывайте положение на карте маркеров
реципиентов. Таким способом можно определить направление переноса, но
лишь приблизительное положение на карте точки начала переноса Hfr. Для
более точного картирования возьмите самые близкие к точке начала переноса
маркеры и используйте разведения донорной культуры. Для дальнейшего
уточнения данных по картированию необходимо уже определять время
вхождения маркера или проводить трехфакторные скрещивания.
Обсуждение
1. Эти эписомы F^ несут мутацию, которая препятствует их репликации
при 40°С. Они содержат также /ас+-оперон дикого типа и вставку Тп/0 в
известной ориентации. Эписомы в
56
Раздел I. Эксперименты
штаммах ТТ627 и ТТ629 содержат Tn/О в одной ориентации (ориентации А). В
эписоме штамма ТТ628 Tn/О встроен в противоположной ориентации
(ориентации В) по отношению к направлению переноса.
2. Обычно клетки Salmonella являются Lac-, но могут стать Lac+, если
получат эписому F'/ac+ от Е. coli. Эти чашки следует инкубировать при
30°С, чтобы могли происходить перенос и репликация мутантной эписомы F'.
3. В штрихах из пятен скрещивания могут появиться также и крошечные
колонии. Это колонии реципиента Lac-, выросшие на попавших с каплей
пищевых добавках или из-за перекрестного питания, обеспечиваемого
большими колониями Lac+. Поэтому в данном эксперименте отбирайте уколом
лишь большие колонии.
4. Чтобы избежать вырезания F'/ac+, штаммы Hfr выращивают в селективных
условиях. Важно быстро выделить и использовать эти штаммы Hfr. Если перед
тем, как их использовать, с этими штаммами длительно работали (т. е.
проводили повторную их очистку или хранили их), то в них могли произойти
перестройки, затрудняющие интерпретацию полученных результатов. Если же
штаммы Hfr использовали сразу же после их выделения, то ориентация
вставок Тп 10 может быть определена однозначно.
Литература
Chumley F. G., Menzel R., Roth J. R., 1979. Hfr formation directed by Tn
10, Genetics, 91, 639.
Раздел II
МЕТОДИКИ
Методика 1
Очистка фага методом бляшек
I. Клетки-хозяева
1. Вырастите ночную культуру любого бактериального штамма,
чувствительного к фагу к (например, штамма BNN45) в среде LB или TYM.
2. Если клетки будут использоваться для высева фага к, то осадите их
центрифугированием (5 мин при 8000 об/мин), ресу-спендируйте в '/г объема
0,01 М MgS04 и храните при 4°С. Если клетки будут использоваться для
высева фага Р22, то разведите культуру и подрастите до экспоненциальной
фазы. После этого клетки охладите и храните при 4°С в ростовой среде.
II.A. Штрихование нижнего агара
1. Петлей или тонкой проволочкой нанесите фаг штрихом на чашку с агаром
LB или на чашку для фага к.
2. К 2,5 мл мягкого агара при 47°С добавьте 20-100 мкл культуры для
высева.
3. Вылейте смесь на чашку, но не прямо на то место, где начинается штрих
