Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
фагов.
Обоснование и план эксперимента
В бляшке фага X содержится много фага и фаговой ДНК. Фаг и ДНК можно
прямо из бляшек перенести на нитроцеллюлозу, если наложить на чашку сухой
нитроцеллюлозный фильтр. После денатурации перенесенной на фильтр ДНК она
оказывается уже готовой для гибридизации. Таким способом можно проверять
до 25 ООО бляшек на одной чашке. Связанную с фильтрами денатурированную
ДНК гибридизуют с ДНК, меченной 32Р с помощью ник-трансляции. После этого
фильтр промывают и экспонируют с ним рентгеновскую пленку. Пятна
почернения на пленке соответствуют гибридизующимся клонам.
Основная методическая трудность.- это сориентировать рентгеновскую пленку
относительно чашки. Для этого мы пользуемся специальным ориентирующим
фагом. Этот фаг содержит фрагмент ДНК, способный гибридизоваться с
определенной меченной ник-трансляцией ДНК (pBR322), а также несет ген
9. Гибридизация бляшек
47
Р-галактозидазы Е. coli. В среду на чашке добавляется Xgal, так что
бляшки ориентирующего фага оказываются голубыми. Кроме того,
ориентирующий фаг гибридизуется с ДНК-зондом pBR322. На чашку
ориентирующий фаг можно нанести случайным образом, добавив его при -
высеве гибридного фага, а можно нанести капли его на определенные участки
чашки. Уколом отбирают бесцветные бляшки в том месте, где была обнаружена
гибридизация, очищают их и проверяют, гибридизуются ли они с меченой ДНК.
Методика
1. Проведите ник-трансляцию примерно 0,5 мкг ДНК (методика 22).
Приготовление чашек для гибридизации in situ.
2. Каждой группе нужно приготовить по восемь чашек LB, на которые в
мягком агаре LB высеяно 104-*-103 фаговых частиц. Инкубируйте при 37°С.
Пользуйтесь чашками, разлитыми за два дня до эксперимента. На каждую
чашку высевайте по 20 мкл клеток BNN45 для газона. При высеве добавьте на
каждую чашку по 10-?0 мкл фага ^gt5-/ac5, pBR322. Можно вместо этого
платиновой проволочкой нанести капли препарата данного фага на уже
готовую чашку. На чашки добавьте также Xgal (внесите в мягкий агар 40 мкл
раствора Xgal 40 мг/мл в демитилсульфоксиде).
Гибридизация бляшек на фильтре
3. Возьмите две чашки, на которых оказалось около 104 бляшек, и две чашки
примерно с 103 бляшек. В каждой группе отберите по две самые
хорошие/чашки с Ы03-3-103 бляшек и по две чашки примерно с 104 бляшек.
Следуйте методике 21-II.
Непременно надпишите каждый фильтр и пометьте его ориентацию. Поместите
фильтры в герметизируемый мешочек с денатурированной ник-транслированной
ДНК, как указано в методике 23, и заварите его. Обязательно наденьте
двойные перчатки, защитные очки и пластиковый фартук.
Экспозиция пленки с фильтром
4. Надрежьте мешочек, в котором проводили гибридизацию, по заваренному
месту и слейте гибридизационную смесь. Разрежьте мешочек и выньте фильтр.
Промойте фильтр, как описано в методике 23. Гибридизационную смесь
поместите в холодильник и храните для повторного использования.
Обязательно наденьте двойные перчатки, защитные очки и пластиковый
фартук. Высушите фильтр. Оберните его пластико-
48
Раздел /. Эксперименты
вой пленкой, чтобы не загрязнить кассету и усиливающий экран.
Экспонируйте фильтр с рентгеновской пленкой (см. методику 24).
Проявите пленку, экспонированную с фильтром
5. Наложите исходную чашку с бляшками на пленку. Отберите уколом
платиновой проволочкой до восьми бляшек с той области чашки, в которой
проявилась гибридизация. Рассейте их методом штрихования сверху до
отдельных бляшек, используя по 1/8 чашки для рассева каждой бляшки.
Переколите таким образом до четырех обнаруживших гибридизацию областей.
Инкубируйте при 37°С в течение по,крайней мере 6 ч. Переколите отдельные
бляшки по шаблону, инкубируйте в течение ночи при 37°С,
Гибридизация бляшек на фильтре II
6. Приготовьте новый фильтр-реплику с тех бляшек, которые были рассеяны и
переколоты по шаблону. После отжига поместите этот новый фильтр-реплику в
новый мешочек, добавьте в него гибридизационную смесь и заварите его.
Обязательно наденьте двойные перчатки, защитные очки и пластиковый
фартук. Начинать все это нужно в начале рабочего дня. Чашку с бляшками
поместите в холодильник.
Экспонирование фильтра с пленкой
7. После гибридизации фильтра II в течение по крайней мере 6 ч выньте
фильтр, промойте его, промокните насухо и оберните пластиковой пленкой.
Экспонируйте с ним рентгеновскую пленку. При необходимости можно
использовать кассету, которой не пользовались для полосок, отпечатанных с
геля. Экспонируйте около 6 ч.
Проявление пленки, экспонированной с фильтром II, и получение препаратов
фага на чашках с агарозой
8. Примерно через 6 ч проявите пленку, экспонированную с фильтром II.
Выявите бляшки, соответствующие гибридизации. Отберите их уколом и
приготовьте препараты фага на чашках. Используйте чашки с агарозой и
следуйте методике 11-II быстрого выделения фаговой ДНК. Выращивайте по
одной чашке каждого фага (от одного до шести). После выращивания в
