Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
трансдуктанты с мутациями могут считаться результатом независимых актов
мутагенеза. В этом эксперименте мы исходим из того, что
температурочувствительные мутанты будут образовывать колонии при 30°С, но
не будут
4. Локализованный мутагенез
3.5
продолжать расти после переноса чашки на высокую температуру. Поэтому
после инкубации чашек при 40°С такие мутанты выявляются в виде крошечных
колоний.
2. (Этап 3); все конститутивные /us-мутанты образуют морщинистые колонии,
если их выращивать на среде с высоким содержанием глюкозы (Murray,
Hartman, 1972).
3. (Этап 4); чашки со стерильными пятнами перепечатывают на чашки-
реплики, содержащие ЭГТА, чтобы предотвратить размножение фага и повысить
вероятность выявления чувствительных к фагу нелизогенных рекомбинантов.
Среда Green+тетрациклин+ЭГТА содержит 1% глюкозы и потому пригодна для
выявления морщинистых колоний, образуемых конститутивными мутантами.
Перепечатывая чашки со штрихами и просмотрев все изолированные колонии,
можно обнаружить температурочувствительных мутантов даже в том случае,
если в исходной колонии содержалось значительное количество ревертантов.
4. (Этап 5); повторный рассев до отдельных колоний проводится для того,
чтобы очистить штамм от фага. Этот рассев проводят на чашках Green +
тетрациклин без ЭГТА, что дает возможность разглядеть на них
чувствительные к фагу колонии.
5. (Этап 7); чувствительность к температуре проверяют на минимальной
среде, так как при этом получаются более четкие результаты. Это относится
не ко всем мутантам, и чувствительность к температуре можно проверить и
на богатой, и на бедной средах. Следует отметить, что в этом случае можно
выявить также и температурочувствительные мутанты детерминанта
устойчивости Тп 10.
Литература
Anton D. N., 1968. Histidine regulatory mutants in Salmonella
typhimurium. V. Two new classes of histidine regulatory mutants, J. Mo'l.
Biol., 33, 533.
Brenchley J. E., Ingraham J. L., 1973. Characterization of a cold-
sensitive hisW mutant of Salmonella typhimurium, J. Bacteriol., II, 452.
Hong J.-S., Ames B. N" 1971. Localization mutagenesis of any specific
small region of the bacterial chromosome, Proc. Natl. Acad. Sci., 68,
3158.
Murray M. L., Hartman P. E" 1972. Overproduction of hisH- and fti'sf-gene
products leads to inhibition of cell division in Salmonella, Clin. J.
Microbiol., 1, 867.
2*
36
Раздел I. Эксперименты
Эксперимент 5
Выделение и характеристика точковых мутантов фага %, полученных с помощью
гидроксиламина
Введение
Часто бывает необходимо получить мутацию в фаговом геноме какого-нибудь
вектора или клона, не прибегая к скрещиваниям, которые могли бы внести
нежелательную чужую информацию (например, сайты рестрикции). С другой
стороны, часто бывает нужно получить мутации в клонированной чужеродной
ДНК. Для этого используется та же самая методика; нужно лишь, чтобы
функционирование встроенной ДНК приводило к такому фенотипу, который
можно выявить. Мутации фага X используются как внешние маркеры при
скрещиваниях, проводимых при картировании мутаций в клонированном
фрагменте, или как такие маркеры, которые дают уверенность, что
рекомбинация произошла внутри клонированного фрагмента.
В качестве модели клонированного фрагмента мы используем ген ТЕМ-р-
лактамазы, который оказался в фаге X в результате встраивания
перемещающегося элемента Тп2.
Обоснование и план эксперимента
Как индуцировать мутации в фаге X гидроксиламином in vitro указано в
методике 8. Это весьма обычный метод мутаге-низирования как фага, так и
выделенной в очищенном виде ДНК. Его преимущество заключается в высокой
специфичности (индуцируются транзицииО->-А) и большой эффективности. При
работе с умеренным фагом контролировать эффективность мутагенеза очень
просто - достаточно следить за появлением среди выжившего фага мутаций,
приводящих к образованию прозрачных бляшек. По этой методике можно
выделить ам-бер-мутантов фага X. С помощью спот-теста на комплементацию
(методика 10) их можно охарактеризовать по их комплементации с амбер-
мутациями в большинстве известных генов фага Л. Комплементационный анализ
позволит определить положение полученных мутаций на карте. Мутации по
ТЕМ-р-лактамазе можно использовать для картирования делеционных мутантов
в этой модели клонированного фрагмента (эксперимент 6).
Методика
1. Приготовьте для газона ночные культуры штаммов DB6430,
DB6431 и DB4383 (и любых других желаемых супрессорных
штаммов; см. список штаммов) в среде TYM.
5. Выделение и характеристика точковых мутантов фага X
37
2. Приготовьте культуры для газона. В данном случае культура для газона -
это просто растущая экспоненциально культура плотностью около 5-108
клетка/мл. Определите титр препарата фага Хатр. Для этого сделайте
последовательные разведения препарата фага, смешайте 0,1 мл разведения с
0,2 мл культуры для газона, инкубируйте смесь 15 мин при комнатной
температуре и высейте на чашку для фага X или на чашку Red (методика 7).
