Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
реципиентный штамм TR5989 (ригВ\2).
8. (Этап 9); чтобы снизить вероятность получения нелизогенных
чувствительных к фагу трансдуктантов, очистку трансдуктантов следует
проводить по возможности сразу после того, как они четко выявятся.
Необходимо проводить очистку нескольких колоний TetR, так как некоторые
из них мо-
28
Раздел I. Эксперименты
гут оказаться двойными трансдуктантами, у которых вставка Тп10 не
сцеплена с геном ригВ. Другие могут проявить лишь слабое сцепление с
геном ригВ.
9. (Этап 10); колонии, в которых активно размножается фаг Р22, должны
быть темно-зелеными, нелизогенные штаммы- светлыми (бледно-зелеными).
Стабильные лизогенные штаммы должны быть слегка темнее нелизогенных, но
достоверно разглядеть это различие трудно.
10. (Этап 15); на этой стадии полезно сохранить два трансдук-танта:
одного, несущего ригВ+ и Тп 10, и другого - мутацию ригВ 12 и Тп 10. Оба
могут пригодиться при конструировании штаммов. Можно выделить лизогенную
пару штаммов (ригВ 12 и ригВ+), сохранив при последнем тесте на
сцепленность по одному трансдуктанту каждого типа; оба штамма будут
содержать ТпЮ вблизи гена ригВ.
Литература
Schmieger Н., 1972. Prage Р22 mutants with increased or decreased
transduction abilities, Mol. Gen. Genet., 119, 75.
Smith H. 0., Levine H., 1967. A phage P22 gene controlling integration of
prophage, Virology, 31, 207.
Эксперимент 3
Делеции, вызванные элементом Тп 10
Введение
Одним из свойств последовательностей-вставок (IS-элементов) и
транспонируемых элементов, обусловливающих устойчивость к лекарственным
препаратам, является их способность вызывать образование делеций (и
других перестроек) (Kleckner et al., 1979; Ross et al., 1979). Исходя из
этого свойства, можно получать набор делеций в интересующей области.
Наличие таких делеций можно использовать для генетического картирования,
а также просто применять в качестве стабильных (неревер-тирующих)
генетических маркеров при отборе.
3. Делеции, вызванные элементом Тп 10
29
Обоснование и план эксперимента
При многих перестройках, индуцированных Тп 10, происходит утрата
детерминант устойчивости к лекарственным препаратам. Поэтому если взять
штамм, содержащий вставку Тп 10 в интересующей нас области, и проводить
отбор клеток, утративших лекарственную устойчивость, то можно получить
популяцию, сильно обогащенную делениями (или инверсиями) вблизи исходного
сайта локализации Тп 10.
Такой эксперимент проще провести, если использовать метод отбора,
разработанный недавно Бохнером и др. (Bochner et al., 1980). Метод этот
позволяет проводить прямой отбор клеток, чувствительных к тетрациклину. С
помощью этого метода легко можно получить популяцию спонтанных мутантов,
а уже затем проверять их на наличие делений желаемого типа. В основе
этого метода отбора лежит предположение (не доказанное), что тетрациклин
проникает в клетки с помощью механизма, предназначенного для транспорта
железа; эта система транспорта может блокироваться индуцибельным
детерминантом устойчивости Тп10. Когда система поглощения железа
блокирована, клетки оказываются неспособными расти на среде с низкими
концентрациями железа. Добавляя в среду соединения, захватывающие железо,
можно сделать рост полностью индуцированных клеток TetR зависимым от
железа, добавляемого извне.
Описанный ниже эксперимент включает поиск делеций, вызываемых Тп 10,
встроенным вблизи /n's-оперона. Кроме делеций могут встречаться и
инверсии, которые препятствуют экспрессии гена hisD, либо нарушая
целостность кодирующей последовательности этого гена, либо отделяя ген
hisD от его промотора.
Трансдукционные скрещивания с донорным фагом, выращенным на ряде точковых
мутантов, позволяют выявить, действительно ли произошла делеция, и
определить размер удаленного при этом участка гена hisD.
Методика
Отбор мутантов, чувствительных к тетрациклину (Tets)
1. Вырастите культуры:
ТТ1151 (hisC869l : : Тп 10, ориентация А),
ТТ1127 (hisC8667 : : Тп 10 ориентация В) или ТТ513 (zee=2 : : Тп 10,
ориентация А).
2. Разведите культуру 1 : 100 примерно до 2-107 клетка/мл. Высейте около
1 • 10(r) клеток (0,05 мл) на чашку со средой Бох-нера. Для каждого штамма
приготовьте около пяти таких ча-
30 Раздел I. Эксперименты
шек, варьируя количество высеянных на чашку клеток от 5-105 до 5-106.
Инкубируйте в течение 24-36 ч при 37°С.
3. Отберите уколом колонии с этих селективных чашек и рассейте штрихом до
отдельных колоний на чашках со средой Бохнера.
Выявление мутантов hisD
4. Отдельные колонии перепечатайте по шаблону на чашки (около 200
колоний). Инкубируйте засеянные по шаблону чашки в течение ночи при 37°С.
5. Перепечатайте чашки, засеянные по шаблону, на пять сред: Е; Е +
гистидин; Е + гистидин + тетрациклин; Е + гистидинол и LB. Инкубируйте в
течение ночи при 37°С.^
6. Выявите мутантов, чувствительных к тетрациклину и неспособных расти на
среде с гистидинолом (hisD~). Отберите уколом таких /ц+П-мутантов Tets и
