Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
mapping of spontaneous and induced mutations in the histidine operon of
Salmonella, Adv. Genet., 16, 1.
42
Раздел I. Эксперименты
Hoppe I., Johnston H. М., Biek D" Roth J. R., 1979. A refined map of the
hisG gene of Salmonella typhimurium, Genetics, 92, 17.
Schmieger H., 1972. Prage P22 mutants with increased or decreased
transduction abilities, Mol. Gen. Genef., 119, 75.
Susskind М. М., Botstein D., 1978. Molecular genetics of bacteriophage
P22, Microbiol. Rev., 42, 385.
Эксперимент 8
Отбор клонов Xgt-his по комплементации
Введение
Если гены, клонированные в векторе К, экспрессируются в клетках Е. coli и
могут комплементировать генетический дефект клетки-хозяина, то содержащие
их фаги можно отобрать из всего пула гибридов. Такой тест на
комплементацию можно проводить двумя основными способами. Первый из них
заключается в том, что образуют лизогенную бактерию с гибридным фагом.
После этого проверяют способность полученной лизогенной бактерии расти на
селективных средах. Однако у многих векторов % удалены гены, нужные для
лизогенизации. В этом случае можно использовать фаг-помощник для
образования двойных лизогенов. Второй метод отбора определенных гибридов
фага К заключается в литической комплементации. Обычно фаг К неспособен
размножаться в такой клетке, которая не может расти из-за какого-нибудь
генетического дефекта. Однако если инфицирующий фаг вносит в клетку такой
ген, который комплемен-тирует дефект клетки-хозяина, то клетка
оказывается способной расти и поддерживать размножение этого фага. В
конечном счете заразивший фаг убьет клетку и образуется бляшка.
Обоснование и план эксперимента
Пул гибридных фагов К был создан в результате введения случайных .E'coRI-
фрагментов flHKS. typhimurium в вектор ^gt7. Таким образом было получено
250 000 независимо образованных гибридов. Фаг К не способен заражать
клетки Salmonella, но гены Salmonella экспрессируются в клетках Е. coli.
Заражая клетки Е. coli His- такими фагами, можно провести тест на
комплементацию. Чтобы провести отбор лизогенных бактерий, об-
8. Отбор клонов Agt-his по комплементации
43
разуют двойные лизогены, используя фаг-помощник ^gt4-/ac5. Этот фаг несет
все гены, необходимые для лизогенизации. Он содержит также ген р-
галактозидазы Е. coli, так что его можно отличить от всех используемых
гибридов. Этот фаг--помощник интеграции несет также
температурочувствительную мутацию с1857 в гене Л-репрессора, что
позволяет получать из лизогенных бактерий гибридный фаг, проводя индукцию
температурой. Отбор лизогенных бактерий проводят, заражая клетки His-
смесью гибридных фагов и фага - помощника интеграции и высевая их на
минимальные чашки без гистидина. Колонии, вырастающие на этих чашках,
образованы клетками, которые содержат гибридный фаг, комплементирующий
данный дефект клетки-хозяина. Эти клетки или содержат гибридный фаг,
супрессирую-щий дефект His-, или просто являются ревертантами. Поскольку
используются большие количества фага, то и в том и в другом случае
колойии будут, вероятно, содержать фаг - помощник интеграции и один или
несколько гибридных фагов. Чтобы отличить супрессию в результате
комплементации от реверсии, из колоний, выросших на минимальных чашках,
выделяют фаг. Для этого проводят термоиндукцию культуры, т. е.
подращивают ее в течение короткого времени при 42°С. Гибридный фаг из
этих клеток можно отличить от фага - помощника интеграции, проведя высев
на чашки с Xgal (5-бром-4-хлор-3-индолил-р-П-га-лактозидом)-хромогенным
субстратом р-галактозидазы. Гибриды образуют бесцветные бляшки, а
помощник интеграции - голубые. Затем можно провести тест на
комплементацию гибридного фага с исходным мутантом, а также и с другими
мутантами.
Литическая комплементация гораздо проще. Клетки His-заражают пулом
гибридных фагов и высевают на минимальные чашки без гистидина. Тот фаг,
который комплементирует клетки His-, должен бы образовывать бляшки.
Однако все клетки заражены и потому не могут расти и образовывать газон.
В результате если проводить высев обычным образом, то должны бы
образоваться бляшки (прозрачные пятна) на прозрачной чашке. Поэтому
важно, чтобы на такие чашки высевалось очень много клеток - столько,
чтобы чашка слегка замутилась. Тогда можно будет ясно разглядеть
прозрачные бляшки. Так как во время литического цикла происходит активная
транскрипция генома фага X, то желательно, чтобы клонированная
последовательность, попавшая в центральную область генома фага,
транскрибировалась и с какого-нибудь фагового промотора. В этом случае
встроенные гены могут экспрессироваться во время литического цикла
инфекции, даже если при них нет собственного промотора. Поэтому фаг,
выявленный на основании результатов комплементации при литической
инфекции, может быть и неспособным комплементировать в двойном лизогене.
Поскольку бля-
44
Раздел I. Эксперименты
шка образуется в результате нескольких последовательных циклов инфекции,
