Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
то реверсии клеток, как правило, не приведут к образованию бляшек
некомплементирующим фагом.
Методика
1. Отдельной колонией Е. coli RD100 (his В463) засейте 40 мл минимальной
среды с гистидином и мальтозой (без глюкозы). После того как культура
вырастет почти до насыщения, от-центрифугируйте клетки и ресуспендируйте
в 1/10 объема 10 мМ MgS04, чтобы получить концентрацию 1010 клетка/мл.
Вырастите также 40 мл культуры BNN45 в бульоне TYM для обычного высева
фага X на чашки (см. методику 1).
Отбор лизогенов
2. Высейте пул гибридных фагов X на чашки с газоном Е. coli His- и
проведите отбор лизогенов. В качестве помощника интеграции используйте
фаг A,gt4-/ac5. Приготовьте следующие чашки для отбора:
108 гибридов фага X и 2-109 kgt4-/ac5 на одну минимальную чашку без
гистидина.
107 гибридов фага X и 2-109 ^gt4-/ac5 на одну минимальную чашку без
гистидина.
10(r) гибридов фага X и 2 -109 ?"gt4-/ac5 на одну минимальную чашку без
гистидина.
Высевайте по 5 • 108 клеток на чашку. Инкубируйте при 32°С, так как
помощник интеграции несет температурочувствительную мутацию с1857.
Высевайте на чашки также по отдельности гибриды фага X, фаг Xgt4-lac5 и
клетки His-, чтобы выявить наличие загрязнения или ревертантов.
Литический отбор
3. Высейте на чашки с газоном Е. coli His- пул гибридных фйгов X и
проведите отбор фагов, дающих литическую комплементацию. Разлейте чашки,
не содержащие бромистого этидия в верхнем агаре. Высейте 2-10(r), 2
-105, 2 -104 гиб-
ридных фагов X и по 2-109 клеток на чашку. Используйте, конечно, чашки с
минимальной средой М9 и минимальный верхний агар М9 без гистидина.
Инкубируйте при 37°С.
Просмотрите результаты эксперимента по комплементации (литической и
лизогенной). Проведите очистку бляшек четырех фагов, которые
предположительно дают литическую комплементацию, на чашках LB
(неселективная среда). Отберите уколом четыре колонии лизогенных
бактерий, проявляющих комплементацию, и засейте ими по 1 мл бульона LB.
Выращивайте при 32°С до тех пор, пока культуры слегка не помутнеют (до
107-108 клетка/мл). Растите культуру в те-
8. Отбор клонов A,gt-his по комплементации
45
чение 2 ч при 42°С, чтобы индуцировать лизогенные бактерии. Рассейте
получившиеся культуры штрихом до отдельных бляшек на чашках LB. Для
газона добавьте на эти чашки LB по 20 мкл клеток RD100 или BNN45. В
мягкий агар, используемый для чашек, на которых рассеваете проявившие
лизогенную комплементацию фаги, добавьте 40 мкл раствора Xgal (40 мг/мл).
Это делается для того, чтобы выявить фаг- помощник интеграции (^gt4-
/ac5).
Перепроверка комплементации
4. Проведите перепроверку клонов, которые по предварительным данным
дают комплементацию, на минимальных чашках М9. Отберите уколом бляшки с
чашек LB и ресуспендируйте каждую в 100 мкл среды для разведения фага X.
Выберите четыре фага (бесцветные бляшки) из полученных после отбора
лизогенных бактерий и четыре фага из полученных после литического отбора.
Рассейте штрихом все эти восемь фагов на одну минимальную чашку М9 с
клетками His- и с 2 -109 частиц фага - помощника интеграции. Остаток
используйте для получения препаратов фагов на чашках LB с агарозой. После
инкубации в течение 6 ч при 37°С соберите с чашек урожай. Наливайте в
чашку по 5 мл среды для разведения фага X и оставьте на ночь при 5°С.
Соберите препараты комплементирующих фагов и храните их в закупоренных
аналитических пробирках с несколькими каплями хлороформа.
Просмотрите результаты перепроверки комплементации.
Быстрое выделение ДНК фага X из препарата фага (гибридного и
комплементирующего)
5. Следуйте методике 11-II быстрого выделения ДНК фага X. Используйте
препараты, полученные на чашках с агарозой.
Определение длин рестрикционных фрагментов ДНК гибридных фагов
6. Расщепите по 5 мкл каждой ДНК рестриктазой Eco RI и нанесите на гель
0,7%-ной агарозы. Проведите электрофорез в течение 6 ч при 50 В. Остатки
препаратов быстрых лизатов фага сохраните, чтобы получить потом на чашках
большие количества фагов.
Препараты с чашек
7. Приготовьте по 20 чашек каждого из трех-шести фагов, выбранных на
основе результатов электрофореза в геле (см. выше). Чашки инкубируйте в
течение 6 ч, после чего налейте в них по 5 мл среды для разведения фага X
при 5°С.
46
Раздел I. Эксперименты
Сбор препаратов фага
8. Для выделения фага X следуйте методике 4. Используйте минимальное
количество пробирок. Препарат фага с 20 чашек можно уместить в две
центрифужные пробирки объемом по 45 мл.
Очистка фага в растворе CsCl
9. Ресуспендируйте осажденный фаг в суммарном объеме 1 мл (по 0,5 мл на
каждую из двух пробирок). Следуйте методике 4-1А для осаждения через
ступенчатый градиент.
Эксперимент 9
Гибридизация бляшек
Введение
Можно выявить специфический гибридный фаг по гомологии последовательности
его ДНК с радиоактивно меченной РНК или ДНК. Использованная ниже методика
позволяет осуществлять проверку очень большого количества гибридных
