Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
Инкубируйте чашки в течение ночи при 37 или 34°С.
3. Приступайте к обработке гидроксиламином (методика 8). Чтобы определить
выживаемость и появление прозрачных бляшек в процессе обработки,
отбирайте пробы и высевайте различные разведения их на чашки для фага X
при 34°С. Если хотите выявить амбер-мутации в генах фага X, то
обработанные мутагеном препараты высевайте также на газон штамма DB6431,
который содержит супрессор амбер-мута-ций (или на любой другой
супрессорный штамм; см. список штаммов). Чтобы выявить мутации,
приводящие к отсутствию р-лактамазы, высевайте на чашки Red (методика 7).
4. После того как определен титр обработанных мутагеном препаратов,
высейте фаг на несколько чашек, чтобы получить на них достаточное
количество мутантов.
Обсуждение
Помимо чашек Red существует несколько других способов выявлять наличие
или отсутствие р-лактамазы. Один из них состоит в том, чтобы
лизогенизировать испытуемым фагом какого-нибудь хозяина, а затем
определять устойчивость полученной лизогенной бактерии к ампициллину. Это
можно сделать полуколичественно, если использовать разные концентрации
этого лекарственного препарата. Для этого испытуемый фаг нанесите штрихом
на газон чувствительной к ампициллину (Amps) клетки-хозяина (например,
BNN45) или просто нанесите каплю этого фага на газон. В данном конкретном
случае фага Хатр (который несет амбер-мутацию в гене int) клетка-хозяин
должна содержать также супрессор supE или supF. Инкубируйте чашки в
течение ночи при 34°С (фаг Хатр обладает температурочувствительным
репрессором с1857). На следующий день уколом зубочистки в центр пятна от
капли или в центр бляшки (где находятся лизогенные бактерии) отберите
лизогенные клетки и перенесите его на чашку LB +ампициллин, на чашку LB и
(чтобы сохранить фаг) на чашку для фага X с газоном любой чувствительной
к фагу X клетки-хозяина. На чашки LB и LB + + ампициллин бактерий не
добавляют, так как на них проверяют устойчивость лизогенных бактерий к
ампициллину. А на
38
Раздел I. Эксперименты
чашки с фагом X высевают клетки в мягком агаре, так что фаг на них будет
сохранен.
Второй метод заключается в том, что суспензию фага капают прямо на газон
клеток Amps (например, BNN45) на чашке LB +ампициллин. Клетки в этом
пятне вырастут лишь в том случае, если фаг может лизогенизировать и
передавать устойчивость к ампициллину.
Третий метод состоит в использовании хромогенного субстрата с р-
лактамовым кольцом (87/312 или нитроцефина). Им можно действовать
непосредственно на бляшки или колонии.
Эксперимент 6
Выделение делеционных мутантов %атр
Введение
Одно из основных достоинств фага X в качестве клонирующего переносчика
состоит в том, что очень легко можно отбирать делеционные мутации во
встроенном в фаг X фрагменте чужеродной ДНК. Используя делеционные
мутации, можно быстро картировать основные структурные и функциональные
особенности клонированной ДНК. Если есть много штаммов с различными
концами делеций, то легко можно определить места промоторов, мРНК,
расположение информации структурных генов и т. д.
Обоснование и план эксперимента
Фаг обрабатывают хелатирующим агентом (ЭДТА), вызывающим разрушение таких
головок фага X, которые содержат ДНК сверх определенного количества.
Разрушающее действие ЭДТА зависит от условий, в частности от температуры.
Поэтому можно подобрать такие условия, при которых после обработки ЭДТА
выживают практически лишь делеционные мутанты. У большинства Л-векторов
основная часть содержащейся у этого фага несущественной ДНК уже
делетирована, и поэтому большинство отбираемых из клона делеций будут
делециями, затрагивающими клонированную чужеродную ДНК-
6. Выделение мутационных мутантов %атр
39
Методика
Следуйте методике 9.
Обсуждение
Протяженность делеций можно определить несколькими способами. Первый из
них заключается в том, что попарно скрещивают между собой фаги с
различными делециями. Второй состоит в их картировании с помощью
гетеродуплексного анализа. Третий заключается в том, чтобы испытать
каждую делению на способность рекомбинировать с точковыми мутациями и на
основании этих данных построить карту делений. Если есть время, то можно
попробовать все эти методы. Как проводить картирование, подробно описано
в методике 10. Поскольку нас интересует ген р-лактамазы, то для выявления
тех актов рекомбинации, которые привели к появлению устойчивости к
ампициллину, можно использовать чашки Red (методика 7) или лизогенизацию
с последующей проверкой на устойчивость к этому антибиотику.
Тест с использованием лизогенизации обладает наибольшей
чувствительностью, и его можно провести следующим образом.
Приготавливается Л-чашка с газоном ВNN'45, и на этот газон наносятся
попарно друг на друга капли делеционных и (или) точковых мутантов Amps.
Чашку инкубируют в течение ночи при 34°С. Клетки из центра каждого пятна
переносят с помощью зубочисток на чашку LB +ампициллин и на чашку LB
