Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Девис Р. -> "Генетика бактерий " -> 12

Генетика бактерий - Девис Р.

Девис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. Генетика бактерий — М.: Мир, 1984. — 176 c.
Скачать (прямая ссылка): genetikabakteriy1984.djv
Предыдущая << 1 .. 6 7 8 9 10 11 < 12 > 13 14 15 16 17 18 .. 63 >> Следующая

оказывается гораздо ниже, чем при обычных методах мутагенеза. (Однако
можно столкнуться с множественными мутациями в трансдуцируемой области.)
Использование элементов лекарственной устойчивости расширяет границы
применения этого метода. Избрав в качестве селектируемого маркера
устойчивость к тетрациклину, можно сильно мутагенизиро-вать область
хромосомы вблизи любой вставки Тп 10. Поскольку этот селектируемый маркер
(т. е. устойчивость к тетрациклину) можно поместить рядом с любым
интересующим нас геном (см. эксперимент 2), то такую методику можно
применять в отношении любой области хромосомы.
Обоснование и план эксперимента
В этом эксперименте фаг Р22 (НТ, int~) выращивают на штамме, несущем
вставку Тп 10 вблизи жизненно важного гена
4. Локализованный мутагенез
33
hisW на 47-й минуте карты Salmonella (Anton, 1968; Brenchley, Ingraham,
1973). По этому гену получены чувствительные к холоду условно-летальные
мутации. Такие мутанты при пермис-сивной температуре оказываются
конститутивными по his-опе-рону. Задача заключается в том, чтобы
посредством локального мутагенеза этой области получить условно-летальную
мутацию, чувствительную к повышению температуры. Препарат фага следует
обработать гидроксиламином, как это описано в методике 8. Этот
мутагенизированный препарат фага используется затем для трансдукции
элемента Тп 10 (т. е. устойчивости к тетрациклину) в реципиент дикого
типа (LT2). После этого следует проверка трансдуктантов на наличие
температурочувствительной условно-летальной мутации или нелетальной
конститутивной мутации hisW. Таких трансдуктантов можно идентифицировать
по тому, что они образуют морщинистые колонии на чашках с 2%-ным
раствором глюкозы (Murray, Hartman, 1972).
Методика
Мутагенез области hisW
1. Отдельной колонией штамма LT2 засейте небольшой объем среды (3 мл).
Культуру инкубируйте при 37°С со встряхиванием.
2. По чашке Е+тетрациклин + 2% глюкозы разотрите 0,1 мл клеток LT2 и 0,1
мл препарата фага, выращенного на штамме ТТ5371 (hisW+ zeh-754 : : TnlO)
и сильно мутагенизиро-ванного гидроксиламином (см. методику 8).
Приготовьте 10 таких чашек и инкубируйте их при 30°С до тех пор, пока не
станут видны крохотные (как острие булавки) колонии (т. е. в течение 12-
18 ч). После этого перенесите чашки на 40°С и продолжайте инкубацию, пока
большинство колоний не станут большими.
Идентификация мутантов
3. Поищите на чашках крохотные колонии (потенциальные
температурочувствительные мутанты) и морщинистые колонии (потенциальные
конститутивные мутанты hisW). Отберите уколом крохотные колонии и
рассейте штрихом до отдельных колоний на чашках Green+тетрациклин + ЭГТА.
Инкубируйте чашки при 30°С. Отберите уколом морщинистые колонии и
рассейте их штрихом на чашки Е + тетрациклин+ + 2% глюкозы (по 6-8
рассевов на каждую чашку). Инкубируйте при 30°С.
4. Перепечатайте штрихи потенциальных температурочувствительных мутантов
на три чашки Е+тетрациклин
2-301
34
Раздел 1. Эксперименты
(10 мкг/мл) +ЭГТА. Одну из этих чашек инкубируйте при 30°С, другую - при
37°С, а третью - при 41°С.
Со штрихов каждого потенциального конститутивного йг'х-мутанта отберите
укоЛом но слабоокрашенной морщинистой колонии и определите их
чувствительность к фагу, а также сцепление фенотипа "морщинистее колонии"
с устойчивостью к тетрациклину.
5. Посмотрите, как влияет температура на рост клеток на чашках-репликах.
По возможности отберите уколом по две колонии со штриха каждого мутанта,
рост которого четко подавляется при повышении температуры инкубации.
Пересейте эти колонии штрихом на чашку со средой Green-1-тетрациклин.
Инкубируйте чашки при 30°С.
Проверка фенотипа мутантов и их чувствительности к фагу
6. Из каждого штриха отберите уколом по бледноокрашенной
(предположительно чувствительной к фагу) колонии. С помощью штампа
отпечатайте их на главную чашку со средой Green + тетрациклин + ЭГТА. Эту
главную чашку инкубируйте при 30°С.
7. Перепечатайте потенциальные температурочувствительные мутанты с
главной чашки на чашки со средой Е. Одну чашку-реплику инкубируйте при
25СС (комнатная температура), а другие - при 30, 37 и 40°С.
8. Через 24 ч посмотрите, как выросли колонии на этих чашках. Вырастите в
питательном бульоне при 30°С культуры всех независимых проверенных
температурочувствительных мутантов и всех мутантов, образующих
морщинистые колонии.
9. С помощью перекрестного штрихования проверьте чувствительность
мутантов к фагу. Если есть время, то проверьте сцепление полученной
мутации с Тп 10.
10. Заложите культуры на хранение и занесите в журнал все проверенные
температурочувствительные мутанты и все мутанты, образующие морщинистые
колонии.
Обсуждение
1. (Этап 2); суспензию фага следует обрабатывать мутагеном так, чтобы
сохранялось всего лишь около 0,1% бляшкообразующих единиц. Так как при
этом практически все мутации, имеющиеся в популяции, были индуцированы
мутагеном в свободных фаговых частицах, то все выявленные в скрещиваниях
Предыдущая << 1 .. 6 7 8 9 10 11 < 12 > 13 14 15 16 17 18 .. 63 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed