Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
(служит контролем), чтобы проверить, образуются ли вообще лизогенные
бактерии, устойчивые к ампициллину (AmpR). Такие лизогенные бактерии
будут образовываться лишь в том случае, если испытуемые фаги Amps могут
рекомбинировать между собой.
Эксперимент 7
Картирование делеций
Введение
Скрещивания с использованием делеционных мутаций дают возможность
наиболее достоверно определять расположение му-
40
Раздел I. Эксперименты
тантных сайтов на генетической карте. Результаты блот-гибри-дизации с
рестрикционными фрагментами показывают, затрагивают ли делеции отдельные
конкретные рестрикционные сайты в ДНК. Сочетание этих двух методов
позволяет грубо сопоставить генетическую и физическую карты исследуемой
области. Такое сопоставление дает возможность сравнить фенотипические
дефекты, характерные для отдельных мутаций, с изменениями определенных
областей ДНК. Метод генетического картирования и многие использованные
здесь мутанты описали Хартман и др. (см. обзор Hartman et al., 1971).
Описана и более подробная карта гена hisG (Hoppe et al., 1979).
Обоснование и план эксперимента
Каждой группе нужно дать по пять делеционных his-мутантов Salmonella. Все
эти делеции затрагивают первую треть /us-оперона (hisG, D, С). Нужны
также лизаты осуществляющего общую трансдукцию фага, выращенные на ряде
точковых /us-мутантов, причем лизаты с высоким титром. Для каждого
делеционного мутанта следует провести спот-тест со всеми до-норными
фагами. Необходимо проверить способность каждого скрещивания давать
рекомбинантов His+ (тест "да" или "нет"). Это позволит грубо определить
положение на карте концов делеций. В эксперименте 10 с теми же делециями
будут проведены блот-гибридизации. Совокупность полученных результатов
позволит определить положение сайтов рестрикции на генетической карте и
оценить физические размеры некоторых делеций.
Методика
1. Исходя из отдельных колоний, получите жидкие культуры каждого из
делеционных /us-мутантов и контрольного делеционного мутанта purF 145
(TR5663) или pyrB64 (TR5671). (Эти неродственные ауксотрофы имеются среди
штаммов, которые используются в эксперименте 13.)
2. Разотрите по 0,1 йл каждого мутанта по трем чашкам (Е + 0,005 мМ
гистидина). Подождите, чтобы жидкость полностью впиталась. На поверхность
чашки скрещивания можно сразу нанести капли 25 разных препаратов фага,
если пользоваться ящиком Бертани (матрицей), в ячейки которого внесены
препараты набора донорных фагов. Делают это с помощью "паука" (штампа с
25 металлическими палочками). Пока капли не впитаются, чашки не
переворачивайте. Если нет таких матриц, то капли фага можно аккуратно
нанести на газон реципиента пипеткой. Инкубируйте чашки в течение двух
суток при 37°С. Приготовьте одну чашку, содержа-
7. Картирование делеций
41
щую только фаги (т. е. нанесите их на чашку без бактерий-реципиентов) .
3. Просмотрите чашки и выявите, в каких пятнах контакта донорного фага
с газоном делеционного реципиента имеются рекомбинанты. Исходя из
полученных данных, постройте по возможности более точную карту
использованных мутаций. Если имеющиеся данные не позволяют построить
однозначную карту, то следует повторить некоторые скрещивания с более
высоким разрешением (нанося 0,1 мл суспензии фага и 0,1 мл ночной
культуры на целую чашку).
Обсуждение
1. (Этап 2); среда для картирования делеций содержит низкую концентрацию
гистидина, так что реципиенты могут расти в течение нескольких делений. В
результате повышается количество трансдуктантов, а тем самым и разрешение
картирующих скрещиваний. В качестве положительного контроля,
показывающего эффективность применяемых фаголизатов, использован
реципиент руг В (или pur F). В качестве негативного контроля использован
реципиент с делецией his-3050, в результате которой удаляется весь /it's-
оперон. Такие картирующие скрещивания обладают повышенной
чувствительностью, так как для трансдукции использован мутант фага Р22.
Этот мутант несет мутацию (НТ), которая сильно повышает вероятность
включения материала клетки-хозяина в головки фага (Schmieger, 1972). В
лизате такого мутанта около половины фаговых частиц содержат ДНК клетки-
хозяина (Susskind and Botstein, 1978). Те чашки, которые будут
использоваться в скрещиваниях такого типа, полезно предварительно
инкубировать в течение ночи при 37°С. Они подсохнут, и капли фага быстрее
впитаются, что позволит избежать слияния нанесенных на чашку капель.
2. (Этап 3); если в пятнах на контрольной чашке нет колоний, то пятна
скрещивания можно считать положительными (т. е. указывающими на то, что
рекомбинация происходит), даже если в них оказалось лишь по одной
колонии. Обычно такой слабый ответ нуждается в подтверждении, для чего
проводят скрещивание на целой чашке (0,1 мл суспензии фага и 0,1 мл
полностью выросшей жидкой культуры растирают по всей селективной чашке).
Литература
Hartman P., Hartman Z., Staht R" Ames В. N., 1971. Classification and
