Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Девис Р. -> "Генетика бактерий " -> 8

Генетика бактерий - Девис Р.

Девис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. Генетика бактерий — М.: Мир, 1984. — 176 c.
Скачать (прямая ссылка): genetikabakteriy1984.djv
Предыдущая << 1 .. 2 3 4 5 6 7 < 8 > 9 10 11 12 13 14 .. 63 >> Следующая

8. Методы хранения бактериальных штаммов описаны в приложении 3. Правила
обозначения мутаций и штаммов приведены во введении.
Литература
Chan R. К., Boistein D., Watanabe Т., Ogata Y" 1972. Spezialized
transduction of tetracycline resistance by phage P22 in Salmonella
typhimurium. II. Properties of a high-frequency-transducing lysate,,
Virology, 50, 833.
Chumley F" Roth J. R., 1980. Rearrangement of the bacterial chromosome
using Tn 10 as a region of homology. Genetics, 94, 1.
Chumley F., Manzel R., Roth f. R., 1979. Hfr formation directed by Tn 10,
Genetics, 91, 639.
Kleckner N., Roth J. R., Botstein D., 1977. Genetic engineering in vivo
using translocatable drugresistance elements. J. Mol. Biol., 116, 125.
Kleckner N., Chan R., Туе B.-K., Boistein D., 1975. Mutagenesis by
insertion of a drug-resistance element carrying an inverted repetition,
J. Mol. Biol., 97, 561.
Levine Al, Curtiss R., 1961. Genetic fine structure of the с region and
the linkage map of phage P22, Genetics, 46, 1573.
Schmid М., Roth J. R" 1980. Circularization of transduced fragments: A
mechanism for adding segments to the bacterial chromosome, Genetics, 94.
15.
24
Раздел I. Эксперименты
Эксперимент 2
Выделение вставок Тп 1Q вблизи определенных генов
Введение
Часто бывает очень удобно, если вблизи интересующего нас гена находится
какой-нибудь генетический маркер. Наличие такого маркера позволяет
избирательно перемещать этот ген в другое генетическое окружение. Такой
маркер можно использовать и при локализованном мутагенезе (см.
эксперимент 4). Элементы, сообщающие устойчивость к лекарственным
препаратам, можно использовать для получения такого селектируемого
маркера почти в любой точке хромосомы. Предлагаемый эксперимент состоит в
выделении вставок Тп 10 вблизи, но не внутри определенной интересующей
нас области (гена ригВ).
Обоснование и план эксперимента
Набор клонов со случайными транспозициями Тп 10 получают в точности так,
как это описано в эксперименте 1. Смешивают примерно 2000-5000 таких
клонов и на такой смеси инсерционных мутантов бактерий выращивают фаг,
осуществляющий неспецифическую трансдукцию. Затем полученным препаратом
фага трансдуцируют какой-нибудь мутант по интересующей области. Проводят
отбор клеток, у которых восстановлена мутантная функция (в данном случае
отбирают клетки с замещенной областью ригВ). Каждый трансдуцированный
фрагмент получен от донорной клетки, которая в какой-то точке хромосомы
содержала Тп 10. Вероятность того, что переданный при трансдукции
фрагмент хромосомы донора с геном ригВ+ получен от клетки со вставкой Тп
10, находящейся вблизи этой интересующей нас области, оказывается вполне
удовлетворительной (около 0,01). В этом случае элемент Тп 10 может
наследоваться вместе с селектируемой областью. В действительности от 0,01
до 0,001 трансдуктантов на самом деле оказываются устойчивыми к
тетрациклину (TetR). Большинство из них должно нести вставку Тп 10 вблизи
Я5учаемой области. (Некоторые могут быть двойными трансдуктантами, у
которых элемент Тп 10 встроен в каком-то сайте, несцепленном с этой
областью.)'
Методика
Создание пула мутантов со вставками Тп 10
1. Проведите транспозиционное скрещивание (как это описано в
эксперименте 1). Используйте такие количества фага и
2. Выделение вставок Тп 10 вблизи определенных генов
25
клеток, чтобы получить примерно 500 колоний трансдуктан-тов на чашку.
Сделайте десять таких чашек. Инкубируйте их двое суток при 40°С.
2. В каждую чашку налейте по несколько миллилитров бульона LB с ЭГТА (10
мМ). Пользуясь стеклянным шпателем, суспендируйте колонии в этой жидкости
и все суспензии слейте в один сосуд. Хорошо перемешайте. Разведите
суспензию до примерно 108 клетка/мл в среде LB + ЭГТА+тет-рациклин (10
мкг/мл). Инкубируйте в течение ночи при37°С со встряхиванием.
Выращивание трансдуцирующего фага на пуле инсерцион-ных мутантов
3. Дважды промойте культуру собранных вместе инсерцион-ных мутантов со
вставками. Для этого два раза отцентри-фугируйте клетки, ресуспендируя их
в среде Е. Промытой суспензией засейте 1,0 мл бульона LB, чтобы получить
препарат лизата трансдуцирующего фага Р22 (см. методику 3). Остаток
промытого пула инсерционных мутантов сохраните.
4. Смешайте полученную свежую ночную культуру с 4,0 мл бульона с фагом
Р22 (среда LB, содержащая 5-10(r) БОЕ/мл фага Р22; см. методику 3).
Инкубируйте, встряхивая при 37°С в течение 5-48 ч до тех пор, пока не
наступит лизис. Если лизиса не произойдет даже и через 18 ч, переходите к
следующим этапам. Такой способ выращивания фага описан в методике 3.
5. Проведите центрифугирование, Чтобы осадить клетки и их обломки.
Надосадочную жидкость слейте в пробирку с 0,25 мл хлороформа. Энергично
перемешайте в смесителе Vortex, чтобы простерилизовать лизат. Полученный
лизат должен содержать 1010-10й БОЕ/мл.
Выделение мутантов со вставками Тп 10
6. Вырастите культуру TR5989 (ригВ\2).
7. Проведите трансдукционное скрещивание на среде Е, высевая 0,1 мл
Предыдущая << 1 .. 2 3 4 5 6 7 < 8 > 9 10 11 12 13 14 .. 63 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed