Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
уранилацетатом. Это очень быстрая методика, и ее действительно можно с
успехом использовать в тех случаях, когда нужно качественно определить
размеры молекул в образ-
52
Раздел I. Эксперименты
це ДНК или их пространственную топологию. Вторая часть предлагаемого
эксперимента заключается в образовании гетеродуплексов и их визуализации
с использованием методики повышения концентрации формамида. В первую
очередь следует провести гетеродуплексный анализ фагов. Затем можно
провести и картирование делеций, полученных при выполнении этого курса.
Методика
1. Демонстрирование и опробование электронного микроскопа.
2. Демонстрирование водных препаратов ДНК для электронной микроскопии.
Для этого нужен препарат ДНК- Следуйте методике 27.
3. Демонстрирование формамидных препаратов ДНК для электронной
микроскопии. Для гетеродуплексного анализа необходимы препараты фага.
Следуйте методике 28.
4. Сделайте фотографии гетеродуплексов с наилучших из полученных сеточек.
5. Электронно-микроскопический гетеродуплексный анализ исследуемого фага.
Эксперимент 12
Субклонирование из фага Я в плазмидном векторе
Введение
ДНК, клонированную в фаге Я, можно перенести в плазмид-ный вектор. Так
как размер плазмидного вектора меньше размера вектора Я, то многие
методики рестрикционного картирования и определения нуклеотидных
последовательностей в этом случае значительно упрощаются.
Обоснование и план эксперимента
Для субклонирования используется векторная плазмида pBR322. Этот вектор
является AmpRTetR Выделяют ДНК этой плазмиды и проводят ее очистку
равновесным центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия с
бромистым эти-
Субклонирование из фага \ в плазмидном векторе
53
днем. Для субклонирования можно пользоваться несколькими ферментами, но
нужно заранее решить, какую рестриктазу будете для этого использовать.
Лучше всего, однако, использовать рестриктазу ?coRI, так как именно этот
фермент и использовался для получения гибридных фагов. Субклонирование
может быть облегчено использованием двух рестрикционных ферментов (когда
и вектор, и субклонируемый фрагмент расщепляют двумя ферментами, например
EcoRl и Sail).
Методика
1. Рассейте штрихом до отдельных колоний штамм RD103-НВ101 (pBR322).
Проверьте штамм RD103 на устойчивость к тетрациклину и ампициллину.
Проверенную культуру сохраните.
Посейте 100 мл ночной культуры RD103.
Выделение ДНК pBR322.
2. Следуя методике 12-1, выделите плазмидную ДНК из 100 мл культуры НВ101
с плазмидой pBR332. Используйте объемы для одной пробирки от ротора 50
Ti.
Из градиента отберите ДНК pBR322 и Экстрагируйте из нее бромистый этидий.
Осадите ДНК этиловым спиртом или диализуйте ее против 0,1 М NaCl, 0,05 М
и трис (pH 7,5) и 0,1 мМ Иа2-ЭДТА.
Вырастите ночные культуры штамма RD102-HB101A.
Выделение ДНК фага К
3. Следуя методике 11-1, выделите ДНК фага К, используя примерно половину
препарата фага.
Перенесите фрагмент (фрагменты) ДНК из фага К в плазмиду pBR322.
Расщепите ДНК рестриктазой ?coRI или смесью рестриктаз. Впзьмите 20-50
частей (по весу) ДНК гибридного фага X на 1 часть ДНК плазмиды pBR322.
Ковалентно соедините их, обработав ДНК-лигазой фага Т4. Проведите
трансфекцию клеток RD102, проводя отбор либо на устойчивость к
тетрациклину, либо на устойчивость к ампициллину.
54
Раздел I. Эксперименты
Эксперимент 13
Встраивание F'tslac+t направляемое Тп 10
Введение
Транспонируемые элементы могут выступать в качестве областей гомологии
при различных генетических процессах, приводя к образованию делеций,
дупликаций, транспозиций и, по-видимому, инверсий тех или иных фрагментов
хромосом. Цель предлагаемого эксперимента заключается в попытке провести
одну из таких операций. В данном случае транспрзон Тп 10 будет
использован в качестве области гомологии между эписомой F' и хромосомой
бактерии. Рекомбинация между такими элементами Тп/0 может обусловить
встраивание эписомы F' в хромосому, что приведет к образованию штамма
Hfr. Если определить точку начала переноса этого Hfr и направления
переноса, то можно узнать положение элемента Тп 10 в хромосоме и его
ориентацию (Chumley et al., 1979).
Обоснование и план эксперимента
Каждая группа использует по две случайные неохарактери-зованные вставки
Тп 10 в хромосому Salmonella (полученные в эксперименте 1). Должно быть
определено положение этих элементов Tn/О на генетической карте и их
ориентация. Идея заключается в том, чтобы встроить плазмиду F'ts1nl0lac+
в тот элемент Tn/О, который находится в хромосоме. Полученный в
результате этого штамм Hfr скрещивают затем с различными реципиентами,
определяя в результате точку начала его переноса и направление переноса.
Таким образом, определяется локализация и ориентация последовательностей
Tn/О в хромосоме.
Методика
1. Посейте LB-культуры штаммов со встроенными в хромосому элементами
Tn/О. Посейте также культуры (при 30°С) штаммов с эписомами F'ts
TnlOlacd- (ТТ627, ТТ628 и ТТ629).
2. Перенесите эписомы F,s в каждый из мутантов со случайной вставкой Тп
