Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
все такие колонии на отдельные ячейки на чашке Green+тетрациклин + ЭГТА.
Инкубируйте чашки при 37°С.
5. Перепечатайте засеянную по шаблону чашку (чашки) с потенциальными
ауксотрофами на 11 чашек с диагностическими средами (см. приложение 2),
на чашку с минимальной средой и на чашку со средой Green-f тетрациклин +
ЭГТА. Все чашки инкубируйте при 37°С в течение 24-36 ч. Исходные чашки
сохраните.
6. Просмотрите чашки-реплики. Определите вероятные потребности каждого
ауксотрофа. Проведите повторную очистку ауксотрофов, рассеяв клетки с
чашки-реплики-с богатой средой (Green + тетрациклин + ЭГТА) до отдельных
колоний. Затем из полученных отдельных колоний каждого ауксотрофа засейте
пробирки по 2*мл жидкой культуры. Инкубируйте со встряхиванием при 37°С.
Проверка чувствительности к фагу и пищевых потребностей мутантов
7. Чтобы проверить чувствительность к фагу, нанесите штрихи культур
каждого из потенциальных ауксотрофов на чашку Green-{-тетрациклин (без
ЭГТА) и поперек этих штрихов нанесите штрих фага Р22. На отдельных чашках
с минимальной средой разотрите 0,1 мл каждой культуры. На эти чашки
добавьте по несколько кристалликов того необходимого питательного
вещества, которое было выявлено с помощью диагностических сред.
22
Раздел I. Эксперименты
8. Просмотрите результаты тестов на чувствительность к фагу и тестов с
кристалликами питательных веществ. Все те ауксо-трофы, которые
чувствительны к фагу и которые отвечают на идентифицированное питательное
вещество, можно закладывать на хранение. Приготовьте столбик с культурой
для длительного хранения и занесите штамм в журнал.
Обсуждение
1. Для инъецирования своей ДНК в бактериальную клетку фагу Р22 необходим
кальций. ЭГ'ГА образует комплексы с кальцием и тем самым препятствует
размножению фага. В данном эксперименте выход чувствительных к фагу
трансдуктан-тов повышается в результате того, что предотвращены повторные
циклы развития фага на чашке. Предадсорбция необходима, чтобы фаговая ДНК
могла быть инъецирована до-того, как клетки окажутся на чашке с ЭГТА.
Используемый фаг несет мутацию c2ts, так что высокая температура
препятствует установлению репрессии. Поэтому чашки, на которые высевается
трансдукционная смесь, инкубируют при 40°С.
2. ЭГТА добавляют в среду для того, чтобы предотвратить заражение
чувствительных к фагу клеток каким-либо жизнеспособным фагом, оказавшимся
на трансдукционной чашке.
3. Можно проводить сравнение чашек с богатой и минимальной средой, держа
их против света друг над другом. Обычно аук-сотрофы хорошо растут на
богатой среде, но на чашке с минимальной средой дают лишь очень слабый
отпечаток. В опытах с фагом Р22, размножающимся в клетках Salmonella"
часто используют индикаторные чашки Green (описание см. в приложении 1)
(Levine, Curtiss, 1961). Колонии тех бактерий, в которых активно
размножается фаг Р22, приобретают на таких чашках темно-зеленую окраску.
Колонии незара-женных клеток (и устойчиво лизогенных клеток) оказываются
бледноокрашенными. Эта среда представляет собой по существу богатую среду
с индикатором pH и высокой концентрацией глюкозы. При штриховании
используют чашки без. ЭГТА, чтобы можно было выявить зараженные фагом
колонии.
4. На чашке со штрихами не трогайте темно-зеленые зараженные колонии.
Отбирайте уколом лишь хорошо изолированные слабоокрашенные колонии. В
приложении 11 показано, как расположить колонии на чашке по шаблону.
Чтобы не было перекрестного загрязнения ячеек, матрицы при
перепечатывании иглы штампа должны быть довольно небольшими.
5. Состав 11 диагностических сред приведен в приложении 2. Каждое
питательное вещество входит в состав двух таких
1. Выделение вставок Тп 10, приводящих к ауксотрофности
23
сред. Например, серии присутствует в среде 2 (ее состав перечислен по
вертикали) и в среде 10 (состав перечислен по горизонтали). Таким
образом, мутант, который растет только на средах 2 и 10, нуждается,
вероятно, в серине.
6. Каждый ауксотроф должен расти на двух диагностических средах (см.
выше). Исключение составляют ауксотрофы с множественными потребностями -
это, например, мутанты, нуждающиеся одновременно в изолейцине и валине
(растут только на среде 7), и мутанты, нуждающиеся одновременно во всех
ароматических аминокислотах (растут только на среде 8). Среда 11 содержит
набор таких питательных веществ, которых нет в других средах. В основном
это витамины. Те мутанты, которые растут лишь на среде 11, нужно
проверять на способность расти в присутствии каждого из этих компонентов
по отдельности. (См. приложение 2.)
7. Пипетку на 0,1 мл погружают в суспензию фага Р22 (с2) (образующего
прозрачные пятна) с титром 108/мл. Затем этой пипеткой проводят штрих по
поверхности индикаторной чашки Green и ждут, чтобы влага впиталась. После
того как штрих фага высохнет, поперек него параллельными штрихами,
пользуясь стерильными деревянными палочками или петлей, наносят культуры
бактерий. Чашки инкубируют при37°С.
