Успехи огранической химии, Том 1 - Рафаэль Р.
Скачать (прямая ссылка):
Молекулярный ,вес молекулы инсулина равен 5732 [261, 270], но мономер "инсулина удается получить в растворе только в особых условиях, например в водном растворе хлор-гидрата гуанидина [184], в органических растворителях [134, 251].и при низких концентрациях инсулина в растворах с малой ионной силой, когда белок имеет высокий суммарный заряд [116, 135]. По мере увеличения ионной силы раствора и уменьшения суммарного заряда постепенно происходит ассоциация мономера, приводящая в конечном итоге к образованию нерастворимого изоэлектрического осадка (pH 5,3— 6,1). Кроме того, при нагревании инсулина в кислом растворе образуется осадок, состоящий из ассоциации инсулино-вых фибрилл, которые появляются также в 6 M растворе мочевины [335]. По-видимому, взаимодействие неполярных остатков — основной фактор, обусловливающий стабильность фибрилл, из которых, однако, удается регенерировать кристаллический инсулин путем обработки щелочью [334].
Гемоглобин лошади, не содержащий цистина, представляет особый интерес, так как методом измерения поверхностного натяжения удалось показать [129], что его молекулярный вес равен 12 000. Гидродинамические методы определения дают молекулярный вес около 68 ООО, который при работе с растворами мочевины снижается примерно вдвое [345]. Если
Реагенты, расщепляющие связи в полипептидной цепи
177
ассоциация обусловлена вторичными валентными силами, то следует ожидать, что лишь такие сильно действующие реагенты [307], как мочевина, фенолы, гуанидиниевые соединения, поверхностно-активные вещества и органические растворители типа диметилформамида, могут вызвать диссоциацию, для чего могут потребоваться также очень низкие или высокие значения pH среды. Данные по указанной проблеме являются недостаточными.
Методы разделения
После разъединения полипептидных цепей белка удается выделить отдельные цепи в чистом виде, что сложнее сделать в случае длинных полипептидных цепей [306], чем коротких цепей, для выделения которых в чистом виде можно применять различные методы, например хроматографию на бумаге [320] и на колонке [219, 277], противоточное распределение [331] и ионофорез [10, 266]. В окисленном инсулине, в котором обе цепи сильно различаются по кислотности из-за неодинакового аминокислотного состава, разделение цепей удается осуществить фракционированием солей [263], ионофо-резом [143, 263], распределительным хроматографированием [6] или противоточным распределением [190, 240]. Окисленный химотрипсин, содержащий три пептидные цепи, дает три фракции с характерными свойствами, позволяющими разделять их- комбинацией метода осаждения при рН6 и ионообменного хроматографирования растворимого вещества.
РЕАГЕНТЫ, РАСЩЕПЛЯЮЩИЕ СВЯЗИ В ПОЛИПЁПТИДНОИ
ЦЕПИ
Реагенты, подобные концентрированным кислотам, которые неизбирательно атакуют все пептидные связи, имеют лишь ограниченное значение для расщепления полипептидов с длинной цепью, так как- состав гидролизата по мере удлинения цепи значительно усложняется. Общие вопросы гидролиза полипептидов подробно рассмотрены в обзоре Сэнджера [266]. Следует отметить, что до начала работы по разделению полученной в результате гидролиза смеси пептидов и аминокислот необходимо, чтобы продолжительность гидролиза исследуемого белка или полипептида была оптимальной.
' Ферменты
При использовании ферментов оптимальная продолжительность гидролиза определяется чистотой ферментного препарата и относительной скоростью расщепления различных
12 Зак. 1418
178
Селективное расщепление белков
связей. Скорость расщепления тех или иных связей другими протеиназами, присутствующими в препарате в виде примесей, из-за их малой концентрации, как правило, значительно ниже, чем скорость расщепления связей, по отношению к которым основной компонент ферментного препарата обладает специфичностью. Прекращая инкубирование в тот момент, когда скорость увеличения количества аминогрупп становится-постоянной, удается свести к минимуму неспецифическое расщепление связей. Следует избегать загрязнения реакционной смеси бактериями, особенно при длительном инкубировании; это достигается добавлением консервирующих средств, например мертиолата (1:10 000 частей). Обычные методы контроля за протеолизом подробно описаны [70]; дополнительно можно указать на применение рН-стата [164] и метод анализа концевых групп [114], который позволяет следить за расщеплением индивидуальных связей, в то время как другие методы дают лишь общее число расщепленных связей.
В настоящее время известны только две эндопептидазы, которые специфичны в такой степени, что, зная аминокислотный состав субстрата, можно предсказать вероятное число расщепляемых связей. Оба эти фермента — трипсин и химо-трипсин имеются в продаже в довольно чистом виде, но, поскольку они выделяются из экстрактов поджелудочной железы, в препарате одного фермента возможно присутствие небольших количеств другого. Химотрипсин ингибируется индолом или ?-фенилпропионатом и< кроме того, легче инактиви-руется кислотами [249] и мочевиной ([137]; см. также [227])л поэтому до инкубирования трипсин рекомендуется предварительно обрабатывать одним-из указанных веществ. Трипсин специфически ингибируется рядом'низкомолекулярных белков; этому вопросу посвящек специальный обзор [128]. Только в случае высокой специфичности/примеси могут возникнуть сомнения относительно причины неожиданного расщепления связей.
