Успехи огранической химии, Том 1 - Рафаэль Р.
Скачать (прямая ссылка):
Возможности синтеза, появившиеся в результате установления последовательности аминокислотных остатков, были незамедлительно осуществлены на практике. После определения строения окситоцина [85] и вазопрессина [243] методом последовательного расщепления Дю Виньо с сотрудниками изящно подтвердили их строение прямым синтезом [20, 82, 84]. Описаны другие методы синтеза окситоцина [34, 35, 258, 330]. Синтезированы также другие природные полипептиды — грамицидин S [280] и гипертенсин [256, 279].
Биохимикам удалось создать еще более интересные соединения. Так, блестящим доказательством широких теоретических и практических возможностей, открытых достижениями химии пептидов, явился синтез первого гормона с заданной структурой — оксипрессина [172], в молекуле которого сочетаются структурные особенности окситоцина и вазопрессина и который обладает биологическими свойствами обоих указанных гормонов.
Применительно к белкам с более высоким молекулярным весом существующие методы не позволяют полностью установить последовательность аминокислотных остатков, но делаются попытки свести проблему к выяснению природы «активного центра» молекулы. Например, папаин, содержащий 178 аминокислотных остатков, удается подвергнуть ферментативному расщеплению и удалить 2/з аминокислотных остатков при полном сохранении ферментной активности (в расчете на 1 моль) [148]. Установлено, что ферментная активность связана с сульфгидрильной группой, входящей в состав активного центра. Трипсин и химотрипсин приобретают ферментную активность при разрыве лишь одной пептидной связи в исходных неактивных молекулах [224, 225, 257].
В результате определения концевых групп большого количества белков установлено, что многие простые белковые соединения содержат цепи, в состав которых входит свыше 100 аминокислот. В этом отношении цепи молекулы инсулина,
Введение
содержащие 21 и 30 аминокислот, представляют исключение, хотя, как показал Мидом [214], химотрипсин состоит из трех цепей, две из которых содержат 13 и 50 аминокислотных, остатков соответственно. В подобных коротких цепях некоторые аминокислоты встречаются лишь по одному разу, и строение исследуемого соединения удается установить путем идентификации пептидов с короткой цепью, получаемых сравнительно неспецифическими методами расщепления, например частичным кислотным гидролизом.
В более длинных цепях аминокислотные остатки крайне редко встречаются по одному разу, обычно же в таких цепях имеется не меньше пяти одинаковых аминокислотных остатков. В этих случаях для изучения соединений с длинной цепью требуются -более селективные методы гидролиза, и для установления последовательности аминокислот необходимо выделять полипептиды с более длинной цепью. Однако такие полипептиды с трудом поддаются фракционированию; для каждого выделенного полипептида должны быть определены количественный состав и последовательность сцепления аминокислот.
Эта проблема значительно упростилась бы, если бы нам были известны методы специфического разрыва ограниченного числа пептидных связей, например связей, в которых участвует какая-либо одна аминокислота или родственные ей аминокислоты. Для химика, работающего в области химии пептидов, селективное расщепление белковых молекул является заветной мечтой, которая в настоящее время еще далека от осуществления.
Идеальный реагент для селективного расщепления белков должен отвечать следующим требованиям: 1) вызывать расщепление в условиях, исключающих расщепление связей между другими аминокислотами, и по возможности не приводить к рацемизации; 2) расщепление должно протекать с хорошим выходом каждого из искомых аминокислотных остатков; 3) полученные в результате расщепления осколки должны быть пригодны к фракционированию и очистке.
Природные ферменты наиболее близки к идеальным реагентам специфического расщепления белков. Трипсин является, наиболее специфичным; в отношении других протеиназ установлены отклонения от специфичности, которой следовало бы ожидать на основании изучения их взаимодействия с синтетическими субстратами. Однако известно, что трипсин рас-щерляет пептидные связи, в которых участвует карбоксильная группа лизина или аргинина, имеющих положительно заряженную боковую цепь. До сих пор не обнаружено
166
Селективное расщепление белков
расщепления трипсином других типов связей, но в то же время установлено несколько случаев, когда трипсин не вызывает гидролитического расщепления связей, в которых участвуют указанные выше остатки с положительным зарядом.
Ферменты способны также катализировать образование связей, которые первоначально отсутствовали в изучаемой молекуле [131, 333]. В структурных исследованиях все боль-" шее применение находят протеолитические ферменты, однако при этом не было получено.никаких доказательств образования новых связей в сколько-нибудь заметных количествах. Тем не менее по крайней мере для двух ферментов с различной специфичностью — трипсина и химотрипсина, которые вряд ли способны вызвать образование од*ной и той же связи, потребовалось доказать отсутствие образования новых связей.
