Успехи огранической химии, Том 1 - Рафаэль Р.
Скачать (прямая ссылка):
В промышленности для обработки шерсти [5] вместо надмуравьиной кислоты предпочитают применять надуксусную кислоту, так как она устойчива к действию воды и не раствог ряет шерсть. Надмуравьиная кислота разлагается водой и растворяет значительное, но не постоянное количество шерсти [33]. По специфичности надуксусная кислота не отличается от надмуравьиной, но точная количественная характеристика процесса окисления не установлена.
При изучении строения белков предварительное окисление исследуемого соединения не только высвобождает полипептидные цепи, но и разрушает внутрицепочечные циклы, делая тем самым полипептидную цепь более восприимчивой к ферментативному гидролизу. Например, при действии трипсина на нативную рибонуклеазу фрагментация исходного белка составляет всего 10% фрагментации предварительно окисленной рибонуклеазы трипсином [150], вызывающим разрыв большинства свяЗей, на которые он действует, на 85—100%.
По другому методу цистиновые межцепочечные мостики окисляются бромом или бромной водой, что также приводит к образованию сульфогрупп. В случае цистина выход цистеи: новой кислоты количественный. Однако при попытках окислить цистин инсулина й папаина бромом без предварительного частичного гидролиза продукты окисления были получены с невысокими выходами [316]. Для повышения степени за? вершенности окисления белки предварительно можйо подвергать денатурации или восстановлению. Из окситоцина — одного из низших полипептидов, при окислении бромной водой образуется цистеиновая кислота с хорошим выходом; одновременно наблюдается специфическое расщепление тиро-зилизолейциновой связи (см. ниже раздел «Бромная вода). .
172
Селективное расщепление белков
Восстановление дисульфидных связей
Восстановление дисульфидных связей является более специфической реакцией, чем окисление, в том отношении, что реагенты не затрагивают триптофана и метионина. В качестве восстановителей обычно используются такие простые тиоловые соединения, как тиогликолевая кислота, мёркапто-
R—S—S—R' -f-R'SH RSH + R'—S—S-R" R'—S-S-R" + R"SH ^Tt R'SH + R"—S—S—R"
этанол и цистеин. Равновесные реакции можно сдвигать в требуемом направлении, применяя избыток восстановителя.
В отличие от окисления надкислотами реакционная способность цистиновых связей [109, 201, 238J по отношению к различным восстановителям неодинакова, и полное восстановление, как правило, достигается лишь в определенных условиях. Благодаря легкости окисления —SH-rpynn, особенно в щелочной среде, восстановленный белок обычно стабилизируют реакцией с иодуксусной кислотой, иодацетами-дом или другими реагентами, блокирующими тиоловые группы.
RSH + ICH2CONH2 + OH- —> RSCH2CONH2 + H2O + Г
Для полного восстановления обычно необходимо использовать тиол и реагент, вызывающий разрыв водородных связей, а следовательно, и разделение пептидных цепей. Так, инсулин полностью восстанавливается только тногликолятом в присутствии 8 M раствора мочевины [202], а электрофорез на бумаге в 8 M растворе мочевины позволяет разделить две полипептидные цепи. В отсутствие мочевины цистин восстанавливается не более чем на 2/з. Степень восстановления дисульфидных связей рибонуклеазы [282] также определяется концентрацией мочевины. Тиогликолят при pH 7 в отсутствие поверхностно-активного вещества [209] или гуанидина [171] восстанавливает только одну цистиновую связь из 17 связей, имеющихся в альбуминах человека и быка (мол. вес 65 000). В 0,2 M растворе натриевой соли децилсульфата при рН,-7 в течение 1 час при комнатной температуре восстанавливаются все цистиновые связи.
Желатинизация белков в присутствии мочевины объясняется [158] взаимным превращением тиоловых и дисульфидных групп соседних белковых молекул. Путем разрыва водородных связей и выпрямления цепей белковых молекул мочевина создает условия для разрыва внутрицепочных цистино-
Разъединение полипептидных цепей
173
вых мостиков за счет действия небольшого количества —SH-групп и возникновения новых межцепочечных цистиновых. мостиков, так что образуется более развитая трехмерная структура. Аналогичная реакция обусловливает взаимное превращение в пептидах, содержащих цистин, при гидролизе инсулина [260] в щелочной и кислой средах. При этом удалось выделить большее количество подобных пептидов, чем этого можно было ожидать, исходя из данной структуры белковой молекулы. Очевидно, что реакция протекает по различным механизмам, а перегруппировка блокируется ингибиторами и связывающими —SH-группы реагентами в щелочной среде и тиолами в кислой среде.
Для восстановления цистина в белках можно использовать большое количество кислых и щелочных восстановителей, HO обычно предпочтение отдается тиолам, которые восстанавливают в мягких условиях и не дают побочных реакций. Широко применяются также сульфит и бисульфит, которые с цистином дают эквимолярные количества цистеина и соли цистеин-Б-сульфокислоты [61, 208]. Сесил и Макфи [52, 212], изучая кинетику реакции сульфита с простыми дисульфидами, показали, что при pH > 9 протекает бимолекулярная реакция:
