Успехи огранической химии, Том 1 - Рафаэль Р.
Скачать (прямая ссылка):
t ^TT
трипсином Il Ii
химотрипсином I
пепсином ^
. NH2 . NH2
I I
-(UhSO3H, Глу, Ала, Вал, Сер). Лиз. Асп. Вал. Ала. UhSO3H. Лна
связи, расщепляемые 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66
трипсином I I
¦ T
химотрипсином • I
пепсином • .
—Асп. UhSO3H. Apr. Глу. Сер. Тре. Гли. Сер. Лиз. Тир. Про.
связи, расщепляемые 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93
T I
трипсином химотрипсином пепсином
NH2
—(Асп, Глу, Про, Гли, UhSO8H, Ала). Тир. (Вал, Вал, Про, Гис). Связи, расщепляемые юэ но ш п2 из п4 н5 п6 п7 . и8 н9
трипсином
Г
химотрипсином I
пепсином
Рис. 4. Частичный порядок расположения аминокислот в окисленной рибо
NH2 ' NH2 NH2NH2
I I II.
Сер. Асп. Гис. Мет. Глу. Ала. Ала. Сер. Сер. Сер. Асп. Тир. UhSO3H. Асп. Глу. Мет —
и 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2,9
NH, NH2
I I
Про. Вал. Асп. Тре. Фе. (Глу, Вал, Лей, Сер, Гис). (Асп, Глу, Ала, Вал) —-
42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
1
1" 1" 1~ 1~
Ii- •' I- - I
NH2 NH2 NH2 NH2
III I
Асп. Гли. Тре. Асп. Глу. UhSO3H. Тир. Глу. Сер. Тир. Сер. Тре. Мет. Сер. Илей. Тре —
67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82
NH2 ' NH2 NH2
I ' II'
Асп. Ала. UhSO3H. Тнр. Лиз. Тре. Тре. Асп. Ала. Глу. Лнз. Гис. (Илей, Илей, Вал) -
94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108
Фе. Асп. Ала. Сер. Вал. ОН
120 121 122 123 124
Связи, расщепляемые в первою очередь
? Прочие расщепляемые
нуклеазе и связи в ней, гидролизуемые протеолитическимн ферментами.
190
Селективное расщепление белков
фрагментов исходной цепи. Однако в полипептидной цепи рибонуклеази не происходит ни отщепления N-концевого остатка лизииа [11], ни разрыва лизилпролильной связи —Лиз. Про— (рис. 4). Методом ионообменной хроматографии
41 42
было выделено только тринадцать пептидов (рис. 5) с выходами 50—100% [152]. Эта работа Хёрза, Мура и Стейна может служить образцом для будущих исследований других
',5
1,0
Cl
^ o,s
X 3
а:
f Гяу, Гли,Сер2,Тре] Лиз f 90; 100 %) I6
[Цис.Асл(МНЕ),Длс,Ва',]Ли3(в5;§57с) ДспДрг(2С;зо%)
7
I 23«
JU
Количество вытекаклцейо^
nh3(m
«реагентов,
1,0 1,S 2,0
-Постепенное увеличение pH и [Na*] —
Лиз. Глу.Тре. Ало. Ала. Ало. Лиз (S5; /00 %) [Асп(МН2),Глу (МНг),Алп,Трег] Г
I Лиз(100; '00 %) [ACn(NH5,), Лей.Тре] Лиз (100;S5%)
]
II Cep.APZ(55;5S7.>) ГГлу(МНг),Фе]Арг(75;в5%)
13-11
fO,2HJ>H3,f
m A,_A . Al
3,0 3,5 Q? 4,5
2,Он,рН5,0і35°
Рис. б. Пептиды гидролизата, полученного в результате гидролиза 200 мг окисленной рибонуклеазы-под действием трипсина в течение 20 час [152].
Хроматографирование гидролизата проводилось иа колонке с сульфированным полистиролом (смола даувкс 50-Х2, 150 х 2 ем). Промывная жидкость собиралась порциями по 10 Мл. Для анализа нннгвдрннным способом отбирались аликвотные части (0,5 мл). Цифры в скобках указывают выход после гидролиза в течение 3 и 20 час.
белков с длинными полипептидными цепями. Авторы тщательно определили оптимальное время гидролиза и установили, что оно оказывает заметное влияние на выход трех пептидов, два из которых являются продуктами распада третьего пептида (остатки 38—61), содержащего трудно гидролизую-щуюся связь —Apr. Ци SOaH—.Выход другого пептида (остатки 67—85) резко уменьшается со временем (с 50% через 3 час до 15% через 20 час), но характер расщепления этого пептида не удалось установить, так как в реакционной смеси не было обнаружено продуктов расщепления.
Реагенты, расщепляющие связи в полипептидной цепи 191
Тринадцать основных пептидов, выделенных при гидролизе рибонуклеази, содержат все аминокислотные остатки, входящие в состав этого фермента; исследование осколков позволило точно определить количество остатков двух аминокислот [152]. Порядок соединения пептидов между собой в исходном белке был установлен по результатам исследования пептидов, полученных из рибонуклеази под действием химо-трипсина [154].
Другой метод специфического гидролиза окисленной рибо-нуклеазы предложен Редфилдом и Анфинзеном [249]. Он заключается в защите е-аминогрупп лизина динитрофенильными группами, что препятствует разрыву связей, в которых уча-" ствукэт эти остатки лизина, под действием трипсина. Поскольку на 1 моль рибонуклеази приходится только 4 моля аргинина, в этих условиях можно было ожидать образования всего пяти фрагментов. Это подтверждается результатами анализа. Разрываются только те связи, в которых участвуют остатки аргинина (рис. 4). Связь —Apr. ЦиБОзН— разрывалась зна-
39 40
чительно медленнее, чем остальные связи. Из пяти крупных пептидных фрагментов тот фрагмент, который не содержит аргинина, очевидно, образуется из С-концевого участка окисленной рибонуклеазы, а пептид, полученный при отщеплении N-концевого участка исходной цепи, идентифицируется по его N-концевому остатку. Относительный порядок расположения трех остальных фрагментов может быть установлен путем выделения и идентификации содержащих аргинин пептидов из кислотных и ферментных гидролизатов. Эти пептиды легко обнаружить по даваемым ими специфическим цветным реакциям [320]. Определенная таким образом частичная структура рибонуклеазы совпадает со структурой, предложенной Хёрзом и сотр. [154].
