Успехи огранической химии, Том 1 - Рафаэль Р.
Скачать (прямая ссылка):
R-S—S-R + SOf- 5=± R-S-SO3- + RS-RS-+ H+ ^± RSH
При pH < 9 порядок реакции более сложен. Установлено, что реакционноспособным компонентом является SOl", а не HSOi", и что на скорость реакции заметное влияние оказывают электрохимические факторы. Так, наличие отрицательно заряжённых групп —COO- рядом с дисульфидными связями связывается со снижением скорости реакции, а положительно заряженных групп — с повышением скорости реакции.
Реакция SoI- с инсулином может служить примером зависимости реакции от условий [51]. Так, при pH 2,8—5,5 реакция протекает медленно и происходит разрыв только одной дисульфидной связи; при pH 6,2—7,2 реакция протекает значительно быстрее и разрываются две дисульфидные связи, а при pH > 7,2 благодаря ионизации тиоловых групп реакция становится обратимой; при pH 9 происходит разрыв только 0,4 эквивалента днсульфидных связей. Реакция восстановления может быть доведена до конца при pH 6,5— 7,0 в 8 M растворе мочевины и 3 M растворе хлористого гуа-нидиния, а при pH 7,0—9,0 — в присутствии гидроокиси фе-нилртути (II).
174
Селективное расщепление белков
В последнее время исследован другой метод доведения восстановления до конца [16, 303], заключающийся в обработке сульфитом в таких условиях, при которых тиол вновь окисляется в дисульфид. Образовавшийся дисульфид реагирует далее с другой молекулой сульфита и полностью превращается в —S—SQ3- -группу [61]. В отличие от цистеина группа —S—SOi" устойчива на воздухе, что позволило рекомендовать это производное [303] для стабилизации цистеиновых соединений при хроматографировании на бумаге. Обработка инсулина SOl- и окислителем приводит к высоким выходам соединений этого типа [16, 303]. Кроме того, —S—SO3 -группа легко превращается в другие представляющие интерес группировки, например —S-—CN, которые могут разлагаться снова с образованием тиола [303].
Соединения, содержащие —SCN-группы, легко получить из дисульфидов взаимодействием с растворами цианидов:
R—S—S-R + CN- —»-RS-+ RSCN
" / ' \ /
CH-CH2—S—S-CH2—CH + CN- —у . ¦ / \
\ • ' /
—»- CH-CH2—+ NCS-CH2-CH ' ' / - . \
\ \
CH-CH2-SCN-f ОН" —> C=CH2 + SCN- + H2O
¦ / / • і
II
\ \ \ /
CH-CH2-S-+ C=CH2+ H2O —> CH-CH2-S-CH2-CH + OH-
/ / / \
и .-IH
Однако тиоцианатная группа легко отщепляется от белков при ?-элиминировании [309], в результате которого образуются тиоцианат-ион и остаток аминоакриловой кислоты (II). Рекомбинация остатка аминоакриловой кислоты и цистеинового остатка дает лантионииовый остаток (III), легко образующийся при обработке шерсти и других белок-содержащих материалов растворами цианидов или щелот чей [316].
Таким образом, этот метод не пригоден для разделения полйпептидных Цепей белкового соединения, но может быть использован для селективного расщепления полипептидной цепи (см. раздел «Химические методы», стр. 213).
Разъединение полипептидных цепей
175
Расщепление фосфатных мостиков
Все фосфатные мостики неустойчивы в присутствии щелочи, например 0,25 н. NaOH при 25° [237]. Селективное расщепление различных соединений было достигнуто использованием фосфатаз, которые в простых субстратах специфичны по отношению к различным фосфатным связям [237]. Фосфатные группы, образующие межцепочечные мостики, после превращения в моноэфиры можно выделить в виде неорганического соединения действием фосфомоноэстераз растительного или животного происхождения.
Используя различные ферменты, можно охарактеризовать фосфатные связи в белковом соединении как качественно, так и количественно. Так, в а-казеине на долю моноэфи-ров IV падает 40% общего содержания фосфора, на долю амидоэфиров V —также 40% и на долю пирофосфата VI--20%. В ?-казеине весь фосфор присутствует в виде диэфиров VII, связывающих пептидные цепи. При разрыве мёжцепо-чечных фосфатных мостиков происходит расщепление а- и 8-казеинов на более мелкие осколки.
О о ?
// // -
-О—P-OH . —NH-P—О—
\ . .\ .
ОН ОН;
IV ' V
OO , о
II II Il
—О—P—P-О— —О—P-O
I. I I • - .
он он он
VI VII
В. пепсине,, в котором на молекулу приходится только один атом фосфора, имеется диэфирная связь типа VII, которая должна образовывать внутрицепочечный мостик, так как известно, что пепсин состоит из одной полипептидной цепи [146,329].
Другие типы мостиков
Результаты определения аминокислотного состава большинства белков указывают на наличие такого количества цистина, которого вполне достаточно для образования ди-сульфидных мостиков между известным числом открытых полипептидных цепей. Однако гемоглобин лошадн, имеющий шесть N-концевых валиновых остатков [160, 245], не содержит
176
Селективное расщепление белков
цистина [161], тогда как в авидине, который имеет три N-koh-цевых аланиновых остатка [115], содержится только один остаток цистина [323]. Очевидно, указанные белки должны обладать разветвленной структурой или содержать другие типы Межцепочечных мостиков.
В настоящее время установлено, что многие нативные белки устойчивы к действию различных реагентов, что можно объяснить только мощным взаимодействием различных групп в одной и той же пептидной цепи или взаимодействием полипептидных цепей разных молекул. Влияние водородной связи на повышение стабильности может быть значительным [187], и для разделения двух неполярных боковых цепей в водном растворе требуется больше энергии, чем это следует из расчета вандерваальсовых сил. Это можно отнести за счет энергии, необходимой для разделения молекул воды, удерживаемых вместе водородными связями, которые разрываются во время установления равновесия между неполярными группами и водой [174, 175]. Взаимодействия между небольшими молекулами и белками [182] и между белковыми молекулами [335] рассмотрены в недавно опубликованном обзоре и могут быть проиллюстрированы на примере поведения инсулина в растворе.
