Жидкостная хроматография при высоких давлениях - Энгельгардт Х.
Скачать (прямая ссылка):
Наряду с определением молекулярно-массового распределения полимеров с помощью ситовой хроматографии были также определены радиусы частиц дисперсий полимеров [10]. На силикагеле со средним диаметром пор 12000 А удалось разделить дисперсии поли-метилакрилата с диаметрами частиц от 350 до 2390 А. Элюент ом служила вода, в которую в данном случае был добавлен эмульгатор. Из-за низких «скоростей диффузии» частиц разделение можно вести только при низких скоростях элюента (~ 0,1 мл/мин при внутреннем диаметре колонки 9 мм!). Кривые элюирования для различных дисперсий (350 — 2390 А) показаны на рис. IX.2. Калибровочные кривые дисперсий полистирола и метилметакрштата идентичны. Для частиц диаметром примерно 1 мкм наблюдается только эффект фильтрации, обусловленный особенностями аппаратуры. Эти частицы были вновь получены при промывании колонки.
Используя описанный метод определения молекулярной массы полимеров с помощью ситовой хроматографии, можно решить обратную задачу - быстро определить распределение пор по размерам для насадки [7]. Случайные диаметры пор твердого тела сопоставляют с полисгирольными стандартами и добиваются, чтобы кривые распределения пор, полученные с помощью ситовой хроматографии, совпадали с кривыми распределения, определенными клас-
14*
212
Глава IX
сическим методом (капиллярная конденсация азота, ртутная пороме-трия). С помощью этих измерений найдено, какому диаметру пор D соответствует полистирольный стандарт, который исключается. Зависимость D от молекулярной массы дается следующим соотношением:
q>= 0,62(MW)°'S9.
Среднемассовой молекулярной массе 10000 пробы полистирола, растворенной в хлористом метилене, или диаметру ее клубка по этой формуле соответствует диаметр пор 140 А, а молекулярной массе 3,7 • 106 - диаметр пор 4530 А. Удивительно, что соответствующий полимеру диаметр пор постоянно в 2,5 раза больше [14], чем диаметр клубка, найденный другим способом [15], т. е. для того, чтобы моментально устанавливалось равновесное распределение, диаметр пор должен быть в 2,5 раза больше, чем диаметр клубка полимера.
Этот метод определения кривой распределения пор одинаково пригоден и для мелких (dp > 1 мкм) и для крупных (dp < 150 мкм) частиц. Верхняя граница диаметров пор, которую можно определить, в настоящее время зависит от того, какими фракциями полимеров располагает экспериментатор. Описанный метод, по-видимому, будет совершенствоваться.
2. Использование скоростной ситовой хроматографии в биологии
Использование устойчивых к давлению силикагелей для ситовой хроматографии белков и т. д. ограничено из-за мешающей необратимой сорбции [13]. Путем химической прививки «углеводов» к поверхности пористого стекла можно уменьшить этот мешающий эф-
t, мин
Рис. IX.3. Ситовая хроматография сыворотки крови человека (Pierce Previews, июнь 1974).
Неподвижная фаза: гликофаза G на пористом стекле с контролируемым диаметром пор 170 А; колонка: 100 см х 4,2 мм (внутр.); элюеит: 0,05 мфосфатный буфер, pH 7,0. Главный пик: альбумин, мол. масса % 70000.
Ситовая хроматография
213
500000
t, мин
Рис. IX.4. Элюирование декстранов и полиэтиленгликоля в системе с гликофазой.
Неподвижная фаза: s Si - СН3 — СН2 — О — СН2 — СНОН — СН2ОН иа Si 100, dp % 10 мкм; колонка: 30 см х 4,3 мм (внутр.); элюент: вода, F = 2,1 см3/мии; и = 2,6 мм/с; Ар * 67 атм, детектор: дифференциальный рефрактометр.
Проба: декстраиы (Afw % 500000 и 10000; рафииоза (Afw = 595); полиэтилеигликоль (Afw = 600); инертное вещество D20.
фект, а в некоторых случаях даже полностью исключить. На рис. IX.3 показано разделение сыворотки крови человека на химически--модифицированном пористом стекле. На голом пористом стекле провести это разделение невозможно, так как в этом случае альбумин адсорбируется необратимо. К сожалению, даже подобные модифицированные неподвижные фазы всегда необратимо удерживают часть таких белков, как, например, гемоглобин, каталаза и т. д. Объясняется
214
Глава IX
это, по-видимому, тем, что поверхность носителя сохраняет остаточную активность и что поверхность химически связанной фазы гидрофобна.
Рис. IX.4 показывает диаграмму элюирования декстранов и полиэтил енгликоля 600 на подобной гликофазе. В то время как дек-страны элюируются перед инертным веществом D20 и при этом разделяются в соответствии с величиной молекул, полиэтиленгликоль адсорбируется из воды, используемой в качестве элюента, и частично разделяется на полимергомологические члены. Полиэтиленгликоли с большими молекулярными массами при этих условиях еще сильно удерживаются. Меняя состав элюента или полярные связанные функциональные группы, можно подавить сорбцию полиэтил енг ликолей и разделить их также с помощью ситовой хроматографии.
На гликофазах разделены такие водорастворимые полимеры, как полимерные клеящие вещества и поливиниловые спирты [22], а также декстраны и цитозан (деацетилированный цигин) [23], и другие водорастворимые природные вещества, например биологические экстракты [20, 21, 24]. При разделении последних особенно заметно, что адсорбция или каталитическая активность неподвижной фазы исключены не полностью. Некоторые гидрофильные органические полимеры, например сополимеры этиленгликольдиметилакрилата и по-лиэтиленгликольдиметилакрилата [16], относительно устойчивы к действию давления. Подобные продукты, например меркогель PGM 2000, можно использовать до давлений, составляющих примерно 100 атм. К сожалению, эти гели еще не производятся с различными границами исключения, но для ситовой хроматографии нестойких соединений они пригодны.
