Жидкостная хроматография при высоких давлениях - Энгельгардт Х.
Скачать (прямая ссылка):
3. Изменение буферного раствора
На селективность разделения можно воздействовать, меняя, ионы в элюенте. Иногда разделение удается осуществить только с совершенно специфическими буферными растворами. Примером тому служит разделение сахаров в присутствии буферных растворов борной
Концентрация ЫаН2Р04, моль/л
Рис. VIII.3. Влияние ионной силы на значения к' (пуриновые и пиримидиновые основания).
Ионообменник: н-бутилсульфокислота на меркосорбе Si 500, 45 мкэкв./r; элюент: буферный раствор
фосфата натрия.
Проба: 1 - адеиии; 2 - цитозии; 3 - гуанин; 4 - урацил и тимин.
13*
196
Глава VIII
кислоты [14]: только с борной кислотой сахар образует комплекс, способный к ионному обмену. Со всеми остальными буферными растворами сахара показывают очень низкие значения к', так как они удерживаются только в результате неионообменной адсорбции.
Элюирующая способность анионов и катионов зависит от того, насколько сильно они сами удерживаются соответствующим обменником. Общее правило, определяющее сорбцию неорганических ионов, уже приводилось. Сила адсорбции анионов на классическом сильноосновном анионообменнике убывает в следующем ряду:
цитрат > оксалат > I “ > HSOJ > NOJ > Вг ” > С1 ” >
формиат > ацетат > ОН “ > F ”
На различных коммерческих анионообменниках эта последовательность варьируется. Для слабоосновных ионообменников порядок ионов также несколько меняется, например гидроксильные ионы в этом случае являются сильными элюента ми, так как диссоциация слабоосновных анионообменников в щелочной среде уменьшается.
Для сильнокислотного катионообменника также установлена последовательность адсорбции катионов:
Fe3+ >Ва2+ >Pb2+ >Са2+ >Ni2+ >Cd2+ >Cu2+ >Со2+ > >Zn2+ >Mg2+ >Mn2+ >UOf+ >T12+ > Ag+ >Cs+ >
>Rb+ >K+ >NH^ >Na + >H+ >Li+
У слабокислотных обменников, например у обменников с карбоксильными группами, Н-ионы действуют как наиболее сильные элюенты, поскольку при pH 4,5 эти обменники больше не диссоциируют.
При автоматическом аминокислотном анализе переход от буфера с лимоннокислым натрием к буферу с лимоннокислым литием ведет к общему увеличению к'. Благодаря этому удается разделить важнейшие аминокислоты — аспарагиновую и глутаминовую [15]. Стимулируя образование комплексов компонентов пробы с ионами, которые находятся в элюенте или связаны с обменником, можно направленно влиять на селективность разделения и увеличивать или уменьшать значение к'.
4. Другие методы воздействия
Хотя изменение температуры мало влияет на ионообменное равновесие [5], оно все же может вызвать уменьшение времени удерживания из-за уменьшения, например, неионообменной сорбции. При повышении температуры разделительной колонки обычно получаются более острые и симметричные пики (увеличение коэффициентов диффузии). Эмпирически установлено, что с увеличением температуры от 25 до 50°С коэффициент диффузии удваивается. Селектив-
Ионообменная хроматография
197
ность ионообменного разделения меняется при добавлении к элюен-ту органических растворителей, полностью смешивающихся с водой, например низших спиртов, ацетонитрила, теграгидрофурана. Уменьшение гидратации ионов, изменение диссоциации и комплексообразование могут вести к изменению значений к' и относительных удерживаний. Кроме того, разделительная способность увеличивается с уменьшением вязкости элюента.
При добавлении к элюентам полярных органических компонентов, например спиртов, ионный обмен более или менее подавляется и разделение проходит по механизму распределительной хроматографии. Неподвижная фаза в обменнике при этом состоит из воды, которая адсорбируется в результате гидратации носителей заряда. В то же время элюент состоит из смеси вода — спирт. Такие системы с успехом использовались для разделения сахаров и углеводов (см. [7]).
5. Градиентное элюирование
В ионообменной хроматографии элюирование часто проводят градиентным методом, меняя pH или концентрацию элюента. Ионообменники с органической матрицей меняют объем с изменением pH и особенно с изменением концентрации ионов, что заметно ухудшает проницаемость колонки или ее разделительную способность из-за образования пустот. Такое же влияние оказывает и органический растворитель, добавляемый в процессе градиентного элюирования.
При использовании ионообменников на основе ППМ или силикагелей с модифицированной поверхностью такие проблемы не возникают. Хотя сам фосфатный буфер не должен поглощать в УФ-обла-сти, при градиентном элюировании может наблюдаться смещение нулевой линии УФ-детектора (254 нм) из-за присутствия в фосфатных буферах полифосфатов.
Д. Применение
В принципе в данном разделе следовало бы привести только примеры разделения, проведенного на специально полученных, устойчивых к давлению, ненабухающих ионообменниках. Однако, применяя жидкостную хроматографию при высоких давлениях, удается значительно сократить длительность классических ионообменных разделений, например анализа аминокислот [16, 17], проводя разделение на более мелких ситовых фракциях обменных смол при незначительном увеличении давления. Еще больше сократить длительность анализа можно, заменив «медленную» реакцию с нингидри-ном, например, на реакцию с флурамом (Гофман - Ля Рош), который с первичными аминогруппами дает сильную флуоресцен-
