Жидкостная хроматография при высоких давлениях - Энгельгардт Х.
Скачать (прямая ссылка):
Следует взять за правило проводить разделение проб, о составе которых известно очень мало, по меньшей мере в двух различных системах. Только при этом условии можно достаточно надежно идентифицировать составные части пробы.
Быстрому выбору подходящей разделительной системы может помочь градиентное элюирование. Таким способом можно быстро установить число компонентов пробы. Зная время элюирования и соответствующий состав элюента, можно сделать заключение о полярности составных частей пробы. Все это облегчает выбор элюента для элюирования при изократных условиях. Поскольку всегда существует возможность образования ложных пиков, которые возникают вследствие концентрирования примесей элюента на неподвижной фазе, то при интерпретации пиков следует быть осторожным. Всегда желательны дополнительные изократные разделения. При использовании полярных неподвижных фаз градиентное элюирование начинают с относительно неполярных элюентов, например гептана, переходят к более полярному элюенту, например хлористому метилену, и затем к элюенту, к которому в качестве вытеснителя добавлен компонент с большой элюирующей силой, например 10 — 50%
220
Глава X
изопропанола. Само собой разумеется, этот путь можно сократить. Если неподвижная фаза неполярна, то начинают градиентное элюирование водой и постепенно переходят к чистому метанолу. Однако и в этом случае следует считаться с возможностью появления ложных пиков.
Перенесение методов разделения, известных из классической колоночной хроматографии, в хроматографию при высоком давлении не представляет никаких трудностей. Конечно, это касается только разделительной системы, но не данных по удерживанию. В распределительных системах свойства материала носителя всегда играют некоторую роль, поэтому могут проявиться различия, обусловленные предварительной обработкой носителя.
При перенесении разделительных систем, используемых в тонкослойной хроматографии (ТСХ), в хроматографию на колонке возникают трудности. Прямой перевод значений ТСХ в соответствующие параметры удерживания {к', объем удерживания) жидкостной хроматографии при высоком давлении очень сложен, хотя формально величины Rf и к' связаны следующим соотношением:
^ = 1/1+fc'.
Разумеется, это соотношение справедливо только для идентичных равновесных условий. В разделительной колонке фазовое соотношение постоянное, в то время как в ТСХ объем подвижной фазы в направлении фронта убывает. Состав фаз в колонке постоянный, а в ТСХ на разделение веществ пробы накладывается разделение (фронтальный анализ) растворителя (элюента). Состав подвижной фазы меняется между линией старта и фронтом [4, 5]. Многократно можно было наблюдать образование нескольких фронтов. Скорость перемещения фронта (скорость перемещения подвижной фазы) уменьшается с удалением фронта от уровня проявителя в камере. Поэтому изократность условий при разделении ТСХ невозможна, а это основная предпосылка справедливости вышеуказанного соотношения. По этим же причинам нельзя сравнивать высоту тарелки или число разделительных ступеней в ТСХ и колоночной хроматографии, так как значение h определяют только для постоянной скорости потока, постоянного фазового соотношения, изократных условий и т. д. Само собой разумеется, что число тарелок или высоту тарелки в ТСХ можно получить из величины пятна, однако эти значения нельзя сравнивать с соответствующими значениями, полученными методом колоночной хроматографии.
Допуская справедливость приведенного выше уравнения, хотя из сказанного следует, что это недопустимо, находят, что Rf, равным
0,9, 0,5 или 0,1, соответствуют к', равные 0,1, 1,0 и 9,0. Эти условия разделения ТСХ (0,1 < Rf< 0,9) можно реализовать в разделительной колонке (0,1 < /с' < 10). Достижимое разделение 5—10 пятен в верхней половине пластины ТСХ (0,5 <Rf< 0,9) можно просто
222
Глава X
сравнить с примерно 1000 — 2000 тарелок в колонке. В нижней половине пластины для ТСХ (0,5 с JR у с 0,1) можно разделить примерно такое же количество пятен. Здесь разделительная колонка из-за более широкой области значений к' (1 < к' < 10), вероятно, превосходит ТСХ.
Изложенное свидетельствует о том, что трудности, возникающие при перенесении разделительной системы ТСХ на разделение в колонке, не являются неожиданными. Качественное перенесение в колоночную хроматографию результатов, полученных в ТСХ при использовании неполярного однокомпонентного растворителя, относительно несложно. Если при этом учитывают содержание воды в слое, обусловленное влажностью воздуха, и в разделительной колонке поддерживают те же условия (например, с помощью системы контроля влажности), то можно воспользоваться результатами разделения ТСХ; однако при этом не надо добиваться, чтобы значения к' соответствовали вычисленным из значений Rf. Оптимизировать разделение в хроматографической колонке можно, незначительно меняя полярность элюента.
Целесообразность разделительных систем ТСХ с многокомпонентными проявителями, полярность которых сильно различается, намного более проблематична хотя бы только из-за фронтального, разделения проявляющей жидкости. В этом случае состав проявляющей жидкости и состав фаз, необходимый для элюирования пятен, можно определить только очень приближенно. Чем больше компонентов содержит проявляющая жидкость в ТСХ, тем меньше имеет смысл переносить результаты разделения, проведенного этим методом, на колоночную хроматографию. Данные колоночной хроматографии следует дополнять данными ТСХ. Так, основываясь на результатах разделения ТСХ, очень просто установить, можно ли элюировать все компоненты с помощью выбранного элюента (в стартовом пятне не остается никакой пробы!). Благодаря разнообразию реагентов для обнаружения такое решение можно принять относительно просто. При использовании селективных реагентов по меньшей мере получают дополнительную информацию о составе пробы.
