Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
ма практически во всех случаях без предварительного подбора условий проведения эксперимента. Гельфильтрация обычно проводится на биогеле А — 0,5 м в растворах, содержащих 1 М NaCl [31, 62, 92, 104, 152, 166, 218—220, 224, 225, 267, 276, 289, 297 и др.]. В последнее время появились сообщения об использовании с этой целью сефакрила S—200 [47, 253], сефарозы 2В [180] или 6В [294, 295], а сам процесс иногда проводится при более низких концентрациях (0,2 М — 0,5 М) соли [46, 47, 180]. Обычно на колонки наносятся относительно большие объемы грубых экстрактов, составляющие 4—8% [151, 166, 180, 209, 219, 225 и др.] и даже больше 10% [92, 156, 253 и Др.] от общего объема фракционирующего геля. Эти объемы превышают оптимальные (1—2%), обеспечивающие реализацию эффективной разделительной хроматографии [94]. Поэтому гельфильтра-цию в указанном исполнении следует рассматривать как процедуру, направленную в первую очередь на разделение нуклеиновых кислот и рестриктаз. В связи с этим не следует ожидать высокой степени очистки целевых ферментов. В литературе практически отсутствуют количественные данные, документирующие обсуждаемые показатели в опытах по выделению рестриктаз. В случае Bsp I прирост удельной активности фермента после проведения гельфильтрации грубого экстракта В. sphaericus в типичных для таких опытов условиях составил
1,6 раза [152]. Более высокая степень очистки была достигнута после проведения разделительной хроматографии грубых экстрактов, содержащих рестриктазы Dpn I или Dpn II, которая равнялась 13-ти и 4-х кратной соответственно [159]. В последнем случае хроматография осуществлялась в условиях, оптимальных для фракционирования компонентов анализируемой смеси (объемы грубых экстрактов составили менее 0,5% от объема колонки, заполненной Биогелем А—0,5 м). Однако, такой вариант исполнения гельфильтрации в опытах по выделению рестриктаз является исключением. Поэтому в типичных условиях, принятых в опытах по разделению нуклеиновых кислот и специфических эндонуклеаз, не следует ожидать эффективности очистки последних, значительно отличающейся от таковой, наблюдавшейся в случае Bsp I [152].
Обсуждаемому способу удаления нуклеиновых кислот характерен ряд недостатков. Гельфильтрация практически применима при работе с небольшими количествами биомассы. Высокая ионная сила в этих опытах применяется с целью диссоциации комплекса нуклеиновых кислот и рестриктаз. Однако, в этих условиях диссоциируют и неспецифические нуклеазы, которые, учитывая специфику осуществления экспериментов по отделению нуклеиновых кислот методом гельфильтрации, ориентированных на грубое фракционирование, могут в значительной мере загрязнять целевые ферменты. О низком уровне очистки в таких опытах вообще говорилось выше.
Несмотря на вышеуказанные недостатки, разделительная хроматография как способ отделения нуклеиновых кислот от рестриктаз нашла довольно широкое применение, особенно на лервых порах развития работ по очистке специфических эндонуклеаз [218, 219, 225, 253, 271 и др.].
Учитывая большую разницу в величине заряда белков (рестриктаз) и нуклеиновых кислот в общем случае и его знака в некоторых условиях, вполне понятным является привлечение для решения задачи разделения указанных компонентов ионитов. В одной из первых работ применения с этой целью сорбентов, содержащих ионогенные группы, был использован ГАП {253], на который путем непродолжительного перемешивания с грубыми экстрактами ряда продуцентов из рода Haemophilus сорбировали рестриктазы и нуклеиновые кислоты. Фракционное промывание сорбента порциями элюирующих растворов повышающейся ионной силы позволило добиться отделения нуклеиновых кислот от целевых ферментов и достичь более чем десятикратной очистки последних. Однако, этот прием в дальнейшем не получил распространения, так как для решения обсуждаемых задач были подобраны более удобные в работе сорбенты. В качестве такого, хотя и редко, используется анионит ДЭАЭц.
Процедура разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз с использованием ДЭАЭц проводится в двух вариантах: 1) при значениях ионной силы, исключающих задерживание на сорбенте целевого фермента и не препятствующих сорбции на нем нуклеиновых кислот — в условиях, обеспечивающих разделение целевых ферментов и нуклеиновых кислот уже во время контакта грубых экстрактов с анионитом; 2) в условиях, когда оба компонента связываются анионитом и их разделение осуществляется при последующей элюции с колонки.
Примеры применения ДЭАЭц для удаления нуклеиновых кислот в первом методическом варианте немногочисленны [58, 252, 288]. В случае рестриктазы Bsu I, грубые экстракты пропускали через колонку с указанным сорбентом при повышенной ионной силе (0,3 М К.С1) [58]. Целевой фермент был обнаружен в несорбировавшейся фракции. Нуклеиновые кислоты в указанных условиях проведения эксперимента оказались связанными с сорбентом. Разделение нуклеиновых кислот и рестриктаз Хог I и Xor II при помощи ДЭАЭц осуществлялось в присутствии 0,25 М КС1 [288]. После перемешивания суспензии ДЭАЭц в бесклеточном экстракте в течение 2,5 часов происходила полная сорбция ДНК. Целевые ферменты и незначительная часть РНК. в этих условиях оставались в растворе.
