Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
3.2. Разделение нуклеиновых кислот и рестриктаз
Для отделения нуклеиновых кислот от рестриктаз применяется их высаждение стрептомицинсульфатом (СС) или поли-этиленимином (ПЭИ), двухфазные водные системы, гельфильт-
рация и фракционирование грубых экстрактов на различных сорбентах, т. е. применяются две группы методов — нехроматографические и хроматографические.
3.2.1. Нехроматографические методы
Одним из самых простых классических методов удаления нуклеиновых кислот является их высаждение при помощи СС. Обычно в опытах по выделению рестриктаз с этой целью используется 1—2% конечные концентрации указанного антибиотика. Для применения этого способа практически не существует ограничений в рабочих объемах бесклеточных экстрактов, что может оказаться важным фактором в препаративных опытах. Вышеуказанные особенности обсуждаемого метода удаления нуклеиновых кислот способствовали его широкому использованию в опытах по выделению рестриктаз [20, 23, 28, 52, 73, 98, 107, 115, 122, 126, 142, 145, 146, 167, 186, 234, 264, 265, 296, 303 и др.].
К недостаткам стрептомицинсульфатного метода следует отнести возможную потерю целевых ферментов. Следует предположить, что в каждом конкретном случае распределение нуклеиновых кислот и белков (в том числе нуклеаз, фосфатаз и рестриктаз) между осадком и раствором зависит от индивидуальных свойств этих компонентов и их проявления в условиях конкретного эксперимента. Предположительно соосаждение с нуклеиновыми кислотами может привести как к ощутимым потерям целевых ферментов, так и к их определенной функциональной очистке (в случае избирательного перехода в осадок нежелательных примесей). К сожалению, в литературе, описывающей применение СС для удаления нуклеиновых кислот в опытах по выделению рестриктаз, отсутствуют конкретные данные, отражающие характер распределения компонентов бес-клеточного экстракта между осадком и супернатантом. Поэтому приходится лишь ограничиться замечанием, что наличие сведений об использовании в обсуждаемых экспериментах различных концентраций СС (0,5—4%) [115, 184, 186, 273] может быть принято как указание на возможность при ее помощи влиять на судьбу целевых ферментов и нежелательных примесей. В этом плане представляют интерес данные об ощутимых различиях в выходе рестриктазы EcoR I, выделенной по двум схемам [184, 273], что во многом может быть объяснено неодинаковыми потерями целевого фермента на стадии удаления нуклеиновых кислот, проведенной с использованием различных концентраций СС.
Комплекс СС—ДНК является неустойчивым в условиях повышенной ионной силы [87, 187]. Это его свойство ограничивает возможности вариации условий экспериментов в отношении обсуждаемого фактора с целью регуляции распределения ком-
понентов бесклеточных экстрактов между надосадочной жидкостью и преципитатом и не допускает применения экстракции целевых ферментов из осадков растворами повышенной ионной силы.
Вышеуказанные ограничения стрептомицинсульфатного метода стимулировали поиск других способов удаления нуклеиновых кислот путем их высаждения, что учитывая простоту и возможность масштабирования, оставалось привлекательным приемом. Внимание было обращено на успешное использование полиэтиленимина (ПЭИ) для перевода нуклеиновых кислот в осадок в работах, посвященных выделению ферментов обмена нуклеиновых кислот [66]. Привлекательной стороной применения этого положительно заряженного полимера явилась устойчивость ДНК—ПЭИ комплекса в растворах высокой ионной силы, что снимает ограничения к вариации ее значений в довольна широком диапазоне.
В одной из первых работ [43], посвященных исследованию возможностей использования ПЭИ в опытах по выделению рестриктаз, было апробировано несколько вариантов его применения. Бикл с сотрудниками [43], с этой целью исследовали распределение 16-ти рестриктаз между осадком и супернатантом после добавления ПЭИ (1%) в бесклеточные экстракты при низкой ионной силе (в отсутствие соли) и содержащие 0,1 М NaCl. В последнем варианте во всех случаях в надосадочной жидкости была обнаружена рестриктазная активность. Высаждение нуклеиновых кислот из бесклеточных экстрактов при низкой ионной силе дало неоднозначные результаты. Только в некоторых случаях перехода рестриктаз в осадок их затем удавалось экстрагировать солевыми растворами. В случае рестриктазы Bgl I использование для экстракции даже 0,5 М забуференного раствора NaCl не дало положительного результата, что привело к полной потере фермента. Проблема была решена путем высаждения нуклеиновых кислот из бесклеточ-ного экстракта В. globigii, содержащего 0,1 М NaCl. В этом варианте выполнения опыта Bgl I остался надосадочной жидкости. Бикл с соавт. [43], к сожалению, не привели данных о количественной стороне распределения целевых ферментов между осадком и жидкой фазой в разных вариантах использованного метода удаления нуклеиновых кислот, что не позволяет судить об эффективности этого приема в отношении выхода целевых ферментов. Такие исследования были проведены при разработке схемы очистки EcoR I [48, 263]. В частности Бингхам с соавт. [48] показали, что в присутствии 0,025 М NaCl в растворе остается 0,1% от суммарной активности EcoRI в бесклеточном экстракте. Повышение концентрации соли до 0,3 М позволяет обнаружить в надосадочной жидкости всю рестрик-тазную активность, а в случае 0,1 М — только 28%. При всех использованных концентрациях соли (0,025 М — 0,3 М) ДНК
