Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
159, 218, 253 и др.]. В этих условиях обычно используются высокие концентрации сернокислого аммония, обеспечивающие полноту высаждения целевых ферментов, что, однако, исключает их очистку. Применение такого же варианта высаливания распространено в опытах, преследующих цель разделить рестриктазы и преципитирующие агенты [85, 89, 91, 142, 167, 186, 249, 262, 290, 291 и др.], которые могут интерферировать качественному проведению последующей хроматографической стадии (особенно на катионитах, связывающих СС и ПЭИ). Иногда удаление указанных агентов совмещается с очисткой
целевых ферментов. В таких случаях применяется фракционное высаливание [20, 23, 74, 243, 247, 299 и др.].
Во всех вариантах проведения высаливания (за исключением экстракции белковых осадков растворами сернокислого аммония) в разных экспериментах, преследующих различные цели, достигается концентрирование разбавленных растворов рестриктаз, что является удобным при переходе к хроматографическим стадиям очистки.
Наиболее эффективным и распространенным способом очистки является хроматографическое фракционирование. Характерной чертой использования этого приема для очистки рестриктаз является то, что решение задачи получения функционально очищенных препаратов этих ферментов достигается путем применения ограниченного круга сорбентов. Наряду с «традиционными» сорбентами — ДЭАЭц, ФРП, ГАП, карбоксиметилцел-люлозой и носителями для гельфильтрации для очистки специфических эндонуклеаз в настоящее время используются и сорбенты, для которых предполагается участие в связывании рестриктаз не только ионных, но и гидрофобных и аффинных взаимодействий. В отношении последних двух типов взаимодействия следует отметить, что они во многих случаях только постулированы, но не доказаны соответствующими экспериментами. Тем не менее, апробация новых сорбентов для очистки рестриктаз дала положительные результаты.
По вполне понятным причинам при поиске аффинных сорбентов внимание в первую очередь было обращено на субстрат рестриктаз — ДНК- В ряде случаев для очистки этих ферментов была использована колонка с однонитевой ДНК-агарозой, приготовленной смешиванием расплавленной горячей агарозы с денатурированной дезоксирибонуклеиновой кислотой тимуса теленка по методу Шеллера с сотр. [236]. Предполагалось [217], что с сорбентом преимущественно будут связываться неспецифические нуклеазы, а рестриктазы, субстратом которых является нативная ДНК, окажутся во фракции несорбировавшихся белков. Для некоторых рестриктаз это предположение, согласно утверждению Робертса [217], оправдалось и была получена хорошая их очистка. Наряду с этим было обнаружено, что некоторая часть исследованных специфических эндонуклеаз достаточно прочно связывалась с однонитевой иммобилизованной ДНК и элюировалась градиентом соли острыми пиками. В этом случае тоже наблюдалась значительная очистка этих ферментов от неспецифических нуклеаз. Хроматография на однонитевой ДНК, иммобилизованной на агарозе или целлюлозе, была применена на последней стадии очистки рестриктаз Hha I [174], Bsp I [152] и EcoR I [184]. В качестве сорбента для очистки специфических эндонуклеаз нашла применение и нативная ДНК, иммобилизованная на полиакриламидном геле или целлюлозе, которые были использованы в случае Bsu I [58] и Bbe I
[146] соответственно. В тех случаях, когда приводятся данные о степени очистки, достигаемой при хроматографическом фракционировании на ДНК сорбентах, они убеждают в высокой эффективности этой стадии в отношении очистки рестриктаз [158, 152].
Применение ДНК-сорбентов до сих пор носило эпизодический характер. Это было вполне объяснимо, учитывая необходимость их приготовления в лаборатории и нестабильность, чта ограничивает повторное их использование. В последнее время фирмой «Фармация» налажен выпуск ДНК-сефарозы, которая согласно рекламе допускает многократное применение. Возможно этот факт сыграет определенную роль в более широком использовании ДНК-сорбента в препаративной биохимии рестриктаз.
Предпосылкой для использования гепарина в качестве лиганда для очистки специфических эндонуклеаз послужили сведения об его ингибирующем действии на ряд ферментов, взаимодействующих с ДНК [75, 257]. Первым в практику препаративной биохимии рестриктаз гепарин, связанный с сефарозой, ввели Бикл с соавт. [43], продемонстрировавшие его эффективность в ходе выделения 16-ти ферментов.
Гепаринсефароза (ГС), по мнению авторов, имеет ряд положительных характеристик. Сорбент стабилен, легко регенерируется, может быть использован многократно, обладает хорошими проточными свойствами и высокой емкостью, что позволяет использовать колонки небольшого объема. К положительным свойствам ГС следует отнести и то, что согласно наблюдениям указанных исследователей, часть не специфических эндонуклеаз из бесклеточных экстрактов, полученных после удаления нуклеиновых кислот, или не связывалась с гепаринсефарозой, или элюировались преимущественно при более низкой ионной силе чем рестриктазы.
ГС является одним из немногих «аффинных» сорбентов, для которого была исследована природа взаимодействия с рестрик-тазами. Данные Имбера и Бикла [128] и Гинша с сотр. [120], которые установили, что рестриктазы Bgl II и BamH I конкурентно ингибируются гепарином, не противоречат предположению о биоспецифической сорбции по меньшей мере некоторых специфических эндонуклеаз на ГС.
