Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Несколько больше примеров работ, по сравнению с вышеуказанными, в которых применение ДЭАЭц не ограничивалось удалением нуклеиновых кислот из бесклеточных экстрактов. Взаимодействие необработанных грубых экстрактов [38, 178]
или грубых экстрактов, частично очищенных высаливанием [95, 125, 188, 248], с анионитом в условиях низкой ионной силы реализовывалось в связывании на ДЭАЭц не только нуклеиновых кислот, но и рестриктаз. Последующая элюция колонки растворами повышающейся концентрации соли позволил совместить хроматографическую очистку целевых ферментов со стадией удаления нуклеиновых кислот. В какой мере достигалась последняя цель судить трудно, так как соответствующие данные в цитированных выше работах не приводятся. Опасность хотя бы частичного перекрывания профилей элюции рестриктаз и нуклеиновых кислот реально существует. Так, например, наблюдалась совместная десорбция с ДЭАЭц рестриктазы EcoR I и нуклеиновых кислот при 0,65 М концентрации NaCl [48]. Цитированная работа содержит данные о том, что рестриктаза EcoR I, сорбированная на ДЭАЭц из растворов, не содержащих нуклеиновых кислот, элюируется при 0,1 М концентрации NaCl. Таким образом, связанные с анионитом нуклеиновые кислоты могут влиять на ход хроматографического фракционирования рестриктаз. В общем случае это вряд ли является желательным, так как содержание нуклеиновых кислот и их распределение по молекулярным весам в грубых экстрактах или частично очищенных высаливанием препаратах являются трудно поддающимися стандартизации показателями. Вариация в содержании и полимерности нуклеиновых кислот от опыта к опыту может найти отражение в доле связываемого с ними целевого фермента, что может обусловить невоспроиз-водимость экспериментов. Наверно неслучайно в ряде случаев применению ДЭАЭц предшествовала очистка бесклеточных экстрактов путем их высаливания [95, 125, 188, 248 2881, что было призвано способствовать улучшению хроматографического фракционирования целевых ферментов. Думается, что именно потенциально возможная невоспроизводимость и неоднозначность применения ДЭАЭц для разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз сыграла определенную роль в довольно редком применении этого сорбента для достижения вышеуказанных целей.
ДЭАЭц связывает нуклеиновые кислоты за счет своих анионообменных групп. Как уже отмечалось, это приводит в некоторых вариантах выполнения опытов к одновременной сорбции на ионите как нуклеиновых кислот, так и целевых ферментов, что в принципе не исключает их взаимного загрязнения в ходе хроматографического фракционирования. Этим недостатком не обладают катиониты, в принципе неспособные связывать нуклеиновые кислоты за счет электростатических взаимодействий.
Одним из таких катионитов, используемых для совмещения стадии удаления нуклеиновых кислот и хроматографического фракционирования рестриктаз, является фосфоцеллюлоза
(ФРИ), впервые апробированная с этой целью Грин с соавт. [109]. Ими на примере большой группы рестриктаз, выделяемых из 13 штаммов различной таксономической принадлежности, была продемонстрирована сорбция на ФРИ всех исследованных ферментов их грубых экстрактов, содержащих 0,1 или 0,2 М NaCl. Применение повышенной ионной силы в этих опытах было призвано разрушить комплекс нуклеиновые кислоты— рестриктазы и тем самым способствовать сорбции последних на ФРИ. Последующая отмывка колонки исходным раствором дала гарантированное удаление нуклеиновых кислот, а элюция градиентом концентрации соли — эффективную очистку связанных ионитом целевых ферментов. Казалось бы появление указанной работы, столь наглядно демонстрирующей высокую эффективность проведения стадии разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз, совмещенной с последущим хроматографическим фракционированием последних, должно было вызвать цепную реакцию по широкому применению этого метода. Однако этого не произошло, хотя и имеется немало примеров успешного использования этого приема для очистки ряда рестриктаз: Rsr II [194], Cfr 13 I [50], FokI и Mlu I [260], Kpnl [17], EcoRV [80], Ddel [172], Cfr I [133], Cfr4 I и Cfrlll [30] и CfrlOI [132]. В случае пяти рестриктаз сорбция целевых ферментов из бесклеточных экстрактов осуществлялась из буферных растворов, не содержащих солей, а в случае получения рестриктаз Sna I [201] и Mme I [57], а также гомогенных препаратов BamH I [254] и Mva I [29] — растворы содержали пониженные или повышенные (0,04 М, 0,1 М и 0,08 М и 0,3 М соответственно) концентрации NaCl по сравнению с таковой (0,2 М), использованной в работе Грин с соавт. [109]. Причины, вызвавшие применение указанных модификаций метода Грин с соавт. [109], в цитированных статьях за одним исключением не обсуждаются. Однако, сам факт возможности (или необходимости) проведения этой стадии в растворах различной ионной силы обращает внимание на влияние значений обсуждаемого фактора на достижение поставленной цели. Упомянутое исключение относится к RMva I, для которой было определено, что оптимальная концентрация в оотношении сорбции фермента из грубых экстрактов на PII находится в интервале 0,2— 0,5 М NaCl и показано, что фермент не связывается с PII в отсутствии соли [29].
