Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
(ВЭЖХ) и сорбентов, адаптированных к очистке нативных белков, тоже не осталось без внимания. Общеизвестно, что для ВЭЖХ характерна непревзойденная разделяющая способность и быстрота проведения хроматографического цикла. Препаративная биохимия ферментов рестрикции в большинстве случаев (особенно в случае выделения препаратов новых ферментов для определения их специфичности) характеризуется мелкомас-штабностью. Вышеизложенное, казалось бы указывало на исключительную перспективность применения ВЭЖХ для очистки рестриктаз. Однако, примеров этому пока немного. Три рестриктазы (Ban II, Sac I и Sph I) были очищены в двухстадийной схеме, где на втором этапе была использована Mono Q колонка в режиме ВЭЖХ {56]. На первой стадии, согласно предложенной методике, ферменты подвергались хроматографическому фракционированию в режиме обычной жидкостной хроматографии, на разных для различных ферментов сорбентах. Разработанные схемы очистки были более простыми по сравнению с существовавшими для исследованных ферментов. Вместе с тем следует отметить, что к сожалению, в рассматриваемой публикации [56] не приводятся данные об относительных выходах рестриктаз на стадии ВЭЖХ, т. е. отсутствуют данные о потерях, что является немаловажной информацией, необходимой для оценки перспективности широкого применения тех или иных приемов выделения и очистки ферментов.
В последнее время в литературе появилось еще несколько примеров применения ВЭЖХ для очистки рестриктаз [204, 205]. Колонки Mono Q, Mono S, Polyarion SI фирмы «Фармация» использовались на последних стадиях очистки. Количественные данные характеризующие эффективность этих стадий в рассматриваемых публикациях отсутствуют.
Несмотря на немногочисленность публикаций документирующих применение ВЭЖХ для выделения рестриктаз, думается, что этот вариант хроматографии со временем займет подобающее ему место в этой области препаративной биохимии. Во многом это будет зависеть от разработки новых сорбентов. Вместе с тем уже сейчас имеющиеся данные о возможности за 20 мин хроматографии на колонке Mono Q получить 1—10 тыс. ед. вы-сокоочищенного фермента [56] должно было бы привлечь внимание исследователей, особенно занятых опытами по выделению и характеристике новых ферментов, где важно кратчайшим путем получить несколько сот единиц рестриктазы, пригодной по качеству для определения ее субстратной специфичности.
3.4.2. Новые методические подходы к разработке схем очистки
В тексте в основном шла речь о компоновке схем очистки рестриктаз, т. е. о том какие стадии и сорбенты и в какой последовательности применяются в конкретных случаях. Актуаль-
ным является вопрос о путях подбора схем очистки (особенно в части, касающейся хроматографических стадий), которые в общем случае должны быть идентифицированы для каждого* фермента. Несмотря на довольно большой объем публикаций посвященных вопросам выделения и очистки рестриктаз, часть из которой была рассмотрена в настоящем разделе, данные о том как были подобраны схемы очистки в них практически отсутствуют. Поэтому приходится предполагать, что разработчики следуют общепринятой практике препаративной биохимии белков — т. е. путем эмпирического подбора находят сорбенты,, последовательность их использования и условия проведения процесса. Для этого необходимо в режиме колоночной хроматографии апробировать пригодность выбранных сорбентов в различных условиях сорбции и элюции. Эти процедуры продолжительны, а разработанные схемы очистки часто включают этапы в той последовательности в какой они были испытаны, без рассмотрения других возможных вариантов ее решения.
Другой подход, заключающийся в изучении взаимодействия ферментов с сорбентами в статических условиях (в пробирке), иногда используемый при отработке схем очистки ферментов, не должен обладать перечисленными недостатками. В литературе имеется публикация, посвященная апробации этого подхода в случае разработки схем очистки рестриктаз [29]. Полученные результаты свидетельствуют, что предварительные исследования в статических условиях занимают по сравнению с колоночной хроматографией значительно меньше времени. Кроме того применение статического метода позволяет установить диапазон и характер влияния различных факторов (например, ионной силы) на связывание, что дает возможность, предсказать условия проведения колоночной хроматографии. В результате за краткое время удается апробировать ряд сорбентов, выбрать среди них наилучшие в отношении очистки и выхода целевого фермента и прогнозировать условия элюции в режиме колоночной хроматографии. Принципиальным различием между схемами разработанными путем их конструирования на основе предварительных опытов проведенных в колоночном режиме и в статических условиях является то, что в последнем случае, благодаря нетрудоемкости предварительных опытов, реальным является разработка именно оптимальных схем очистки — оптимальных в отношении спектра выбранных сорбентов, их числа и последовательности применения.
3.5. Выделение гомогенных препаратов рестриктаз
