Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
С расширением объема работ по поиску ферментов рестрикции возникла необходимость в максимально упрощенных методах, позволяющих провести массовое тестирование проверяемых штаммов. Первыми такой методический прием предложили и разработали Уайтхед и Браун [294]. Эти авторы культивировали исследуемые культуры в 4 мл жидкой среды и собранную центрифугированием биомассу суспендировали в буферном растворе, содержащем 25% сахарозы, лизоцим и ЭДТА. После непродолжительной (2 мин) инкубации при 0°С к суспензии добавляли детергент Brij-58, MgCl2 и выдерживали ее 15 мин при комнатной температуре. После этого клетки удаляли центрифугированием, а полученную надосадочную жидкость использовали для исследования на наличие специфической эндонуклеазной активности электрофоретическим методом. Было показано, что предложенный метод оправдывает себя при тестировании представителей самых различных родов микроорганизмов: цианобактерий, грамотрицательных бактерий и бацилл. Вместе с тем он не является универсальным и дал отрицательные результаты в случае проверки Herpetosiphon •giganteus и Streptomyces. Авторы обсуждаемой работы связывают возможность тестирования представителей различных
таксономических групп со способностью используемого приема вызывать образование сферопластов микроорганизмов. Некоторые среди них обладают таким строением клеточной стенки, которая исключает возможность ее пермеализации используемым приемом.
Самым простым известным в настоящее время методом массового скрининга штаммов следует признать способ разработанный Белавиным, Дедковым и Дегтяревым [3]. Предложенный прием представляет собой упрощенный и усовершенствованный метод Уайтхеда и Брауна [294]. Основным различием между ними, позволяющим значительно снизить трудоемкость, является использование в качестве исходного материала биомассы отдельных колоний, выращенных на агаризованной среде. Отличия между обсуждаемыми подходами имеются и на стадии пермеализации клеток. В последнем случае обработка является одноэтапной (15 мин при комнатной температуре) и клетки суспендируются в буферном растворе, содержащем в качестве пермеализующих агентов Тритон Х-100, ЭДТА и ли-зоцим.
Метод отличается большой чувствительностью. Сказанное иллюстрирует тот факт, что в случае проверки в качестве модельного объекта продуцента рестриктазы Fok I F. okeanokoi-tes, отличающегося низким содержанием целевого фермента в биомассе (250 ед./г сырой биомассы), на электрофореграмме наблюдается типичная картина проявления специфической эн-донуклеазной активности. Отличительной чертой экспресс-метода является пока непревзойденная (а по отношению к многим другим подходам и просто не сравнимая) производительность, характеризующаяся возможность в одном опыте, продолжающемся 3—4 часа проверить до 100 отдельных колоний бактерий [3].
Как и в случае метода Уайтхеда и Брауна [294], далеко не все штаммы, относящиеся к различным таксономическим группам микроорганизмов, оказались чувствительными к используемой обработке. Среди проверенных культур положительные результаты были получены со штаммами, принадлежащими к родам Bacillus, Kurtia, Paracoccus, Vibrio, Pseudomonas, Rhodo-pseudomonas, Providencia, Flavobacterium; отрицательные со Streptomyces и Nocardia.
Хотя экспресс-методы скрининга штаммов микроорганизмов на наличие рестриктаз по вышеизложенным причинам не являются универсальными (как и все остальные методы) их максимальная простота позволяет предположить о возможностях широкого их применения в опытах по поиску продуцентов рестриктаз. На основе цитированных работ создается впечатление, что они пригодны для проверки широкого круга таксонов. Случаи отсутствия пермеализации могут быть идентифицированы визуально (например, по отсутствию в экстрактах клеточ-
ных нуклеиновых кислот или неспецифических нуклеаз) и клетки подвергнуты другим методам вскрытия.
Резюмируя рассмотрение методических аспектов поиска специфических эндонуклеаз хотелось бы обратить внимание на еще некоторые принципиальные возможности и недостатки биологического и биохимического подходов. Использование обоих методов не дает полной гарантии, что во всех случаях при наличии в исследуемой культуре целевого фермента он будет выявлен. Очевидно, что этими методами могут тестироваться только те специфические эндонуклеазы, для которых в используемых субстратах имеются узнаваемые ими последовательности нуклеотидов. В случае биологического метода набор субстратов ограничен фагами, способными размножаться и дать лизис на исследуемом штамме. Это ограничение значительно сужает возможности вариации субстратов, тем более, что, как указывалось, наблюдается тенденция отбора фагов с уменьшенным числом сайтов, узнаваемых ферментами СХС их хозяев [141]. В случае же применения биохимических методов теоретически не существует препятствий для использования различных по первичной структуре субстратов и, тем самым, при достаточно большом их наборе можно надеяться значительно уменьшить вероятность отрицательного результата в опытах по поиску продуцентов рестриктаз, обусловленного обсуждаемой причиной.
