Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
практически полностью переходила в осадок, а около одной трети белков и одной пятой РНК оставались в растворе. Часть неспецифических нуклеаз при высаждении нуклеиновых кислот полиэтиленимином из растворов низкой ионной силы оставалась в растворе, что позволило на данной стадии добиться частичной функциональной очистки целевого фермента, полностью оказавшегося в осадке. На основе проведенных прелиминарных опытов была отработана методика соосаждения нуклеиновых кислот и рестриктазы EcoRI (0,1% ПЭИ, 0,025 NaCl) и последующей элюции фермента 0,3 М забуференным раствором NaCl, позволившая добиться двадцатикратной очистки целевого фермента с выходом, превышающим 70%.
В одновременно появившейся работе Сумеги с соавт. [263] подбор условий осаждения EcoR I и нуклеиновых кислот полиэтиленимином и последующей элюции целевого фермента тоже реализовался в аналогичных выходах и степени очистки указанной рестриктазы.
Не вызывает сомнений высокая эффективность полиэтилен-иминового метода в отношении высаждения нуклеиновых кислот. Однако, отмечены случаи, когда проведение такой процедуры не гарантирует последующей сорбции бесклеточног» экстракта на ионитах из-за присутствия в них каких-то не-идентифицированных интерферирующих этому процессу клеточных растворимых компонентов [43]. Выходом из создавшейся ситуации оказалось использование вместо ПЭИ стрептомицин-сульфата или хроматографическое фракционирование грубых экстрактов на ДЭАЭц [43].
После проявления первых, цитированных выше работ, ПЭИ нашел применение в ходе очистки многих рестриктаз [13, 47, 68» 83, 85, 89, 90, 249, 262, 280, 290 и др.]. В этих опытах используются оба обсужденных выше, варианта осуществления эксперимента. При работе с большими объемами биомассы предпочтение отдается варианту, позволяющему разделить нуклеиновые кислоты и целевые ферменты уже на стадии высаждения первых [127, 198]. Это объясняется некоторыми трудностями экстракции соосажденных рестриктаз из объемистых осадков, трудно поддающихся суспендированию.
Эффективным, давно известным способом разделения нуклеиновых кислот и белков, является использование двухфазных водных систем [2]. Однако, примеры использования таких систем в работах, посвященных решению этой проблемы в случае выделения рестриктаз, немногочисленны [119, 179, 202, 298]-Предположительно это связано с необходимостью подбора условий проведения экспериментов, обеспечивающих избирательное распределение компонентов разделяемой смеси между фазами и некоторыми сложностями при переходе на последующую стадию очистки.
Вышеизложенные методы несомненно являются эффективными в отношении решения главной задачи этого этапа выделения ферментов рестрикции — разделения специфических эндонуклеаз и нуклеиновых кислот. Что же касается вопроса об эффективности этих процедур в отношении очистки целевого фермента, то обращение к литературным данным убеждает в практическом отсутствии соответствующих сведений.
Ранее обсуждался пример многократной очистки рестриктазы EcoR I после проведения стадии удаления нуклеиновых кислот при помощи ПЭИ [48, 263]. Скорее всего такая эффективность данной стадии в отношении очистки целевого фермента является исключением. Учитывая то, что фракционированию подвергается сложная смесь клеточных компонентов, содержащихся в грубых экстрактах, а используемые методы не являются избирательными, следует предположить, что в большинстве случаев достигается только эффективное удаление нуклеиновых кислот без сколько-нибудь значительной очистки рестриктаз. Поэтому те немногочисленные примеры работ, в которых приведены количественные данные относительно степени очистки рестриктаз обсуждаемыми способами [13, 127], не противоречащие выше указанному предположению, думается являются типичными.
Низкая эффективность вышеизложенных методов удаления нуклеиновых кислот в отношении очистки целевых ферментов и потенциальная возможность больших их потерь, а также некоторые методические трудности в подборе оптимальных условий проведения этих процедур послужили определенным стимулом для апробации возможности использования на этой стадии очистки рестриктаз хроматографических подходов.
3.2.2. Хроматографические методы разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз
Применение хроматографических методов разделения нуклеиновых кислот и специфических эндонуклеаз основано на использовании с этой целью их разницы в молекулярных весах, значений и величин заряда. Учитывая определенную избирательность используемых с этой целью хроматографических материалов и то, что большая часть процессов по разделению нуклеиновых кислот и специфических эндонуклеаз осуществляется в одной стадии в колоночном режиме, следовало бы ожидать совмещения решения вышеуказанной задачи с определенной как функциональной, так и абсолютной очисткой рестриктаз от сопутствующих примесных нежелательных активностей и белков.
Наиболее простым хроматографическим приемом разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз следует признать гель-фильтрацию бесклеточного экстракта. Эта процедура примени-
