Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
фадексов [9, 46, 172] и других носителей, предназначенных для разделительной хроматографии [47, 52, 126, 238, 243, 290].
Несмотря на общность приведенных выше схем очистки многих рестриктаз, она является в большей степени кажущейся, чем действительной. Это связано с тем, что в каждом конкретном случае необходим индивидуальный подход, выражающийся в подборе условий проведения той или иной стадии и выборе последовательности их применения. Вместе с тем по ходу развития работ по очистке рестриктаз выявилась тенденция создания именно унифицированных (универсальных) схем, пригодных для выделения многих рестриктаз без предварительного подбора условий проведения отдельных стадий и их последовательности. Иначе говоря, по тем или иным соображениям выбирается схема и проверяется ее пригодность для очистки ряда рестриктаз. Первыми этот подход реализовали Бикл с соавт. [43]. Их схема включала обработку бесклеточного экстракта ПЭИ в присутствии 0,1 М NaCl, последующее высаливание белков 70% насыщением раствора сернокислым аммонием, диализ и хроматографическое фракционирование на ГС (градиентная элюция 0,0—1 М NaCl). Применение такой процедуры, согласно утверждению авторов, позволило получить препараты большинства из 16-ти исследованных рестриктаз, по уровню функциональной чистоты пригодные для опытов по физическому картированию, а в некоторых случаях и для секвени-рования ДНК.
В 1978 г. Грин с соавт. [109] предложил методику очистки рестриктаз, включающую последовательное хроматографическое фракционирование на ФРИ и ГАП. Бесклеточный экстракт на первый сорбент наносили без предварительного удаления нуклеиновых кислот. После проведения очистки по обсуждаемой схеме в 13-ти случаев из 16-ти испытанных были получены функционально очищенные препараты исследуемых ферментов, пригодных для использования в качестве аналитических реагентов.
Для получения аналогичных препаратов трех остальных ферментов оказалось необходимым ввести дополнительную стадию очистки, заключающуюся в хроматографии на катионите Биорекс 70.
К попыткам создания унифицированной схемы очистки рестриктаз можно отнести и работу Бекси [32], апробировавших с этой целью прямое фракционирование бесклеточных экстрактов четырех продуцентов рестриктаз различной таксономической принадлежности на голубой сефарозе. Однако, эффективность этого метода была продемонстрирована на небольшой группе рестриктаз и для определения его универсальности необходимы дополнительные исследования.
Все три обсуждаемые схемы выделения были апробированы в трех лабораториях, их разработавших. К сожалению, они не
нашли широкого распространения и поэтому трудно судить о границах их применения, которые несомненно существуют.
Рассмотрение литературных данных позволило выявить еще ряд схем очистки, которые применялись с незначительными вариациями условий проведения отдельных стадий очистки многих рестриктаз. Одной такой схемой является гельфильтрация грубого экстракта на Биогеле А — 0,5 м и последовательная хроматография на ДЭАЭц и ФРИ, эффективность которой документирована по меньшей мере в случае очистки 9 рестриктаз: Atu I [225], Xma I и Xma II [92], Pvu II [104], Hha I [220], Xma III [156], Ара I [240], Atu В VI [224] и Sfa I [297]. В аналогичной другой схеме был изменен порядок использования вышеуказанных ионитов. По этой схеме (гельфильтрация на Биогеле, последовательная хроматография на ФРИ и ДЭАЭц) были очищены следующие ферменты: Alu I [219], FnuD I,
FnuD II [166], FnuH I [164] и HgiA I [62]. Для очистки рестриктаз Hinf I [271], Hind II [253], Нае III [218], BamH [113] и Hph I [151] была применена схема: гельфильтрация на Биогеле
А—0,5 м, высаливание сернокислым аммонием и хроматографическое фракционирование на ФРИ.
При осуществлении некоторых стадий каждой из указанных схем условия проведения экспериментов незначительно варьировали. Если допустить, что эти вариации не являются существенными, то можно предположить их универсальный характер в том смысле, в каком этот термин принят в контексте настоящего обсуждения.
Очевидно, что создание истинно универсальных схем, пригодных для выделения многих рестриктаз, на данном методическом уровне препаративной биохимии белковых соединений является нереальной задачей. Однако, работы по апробации схем очистки, пригодных для выделения хотя бы групп рестриктаз, следует отнести к прогрессивным тенденциям препаративной биохимии этих ферментов. Их разработка и применение призвано способствовать выбору схем очистки новых рестриктаз, выявлению общностей и различий в хроматографическом поведении этих ферментов, что имеет не только теоретическое, но и практическое значение.
3.4. Возможные перспективные направления развития препаративной биохимии рестриктаз
3.4.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография
Учитывая большой и все нарастающий ассортимент ферментов рестрикции, перманентный поиск и выделение все новых рестриктаз, является очевидным, что усовершенствованию методов их выделения постоянно уделяется внимание. Появление методов высокоэффективной жидкостной хроматографии
