Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Гомогенные препараты рестриктаз в первую очередь необходимы для исследований, посвященных изучению их энзиматических и физико-химических свойств, а также структурных особенностей. Исключительно перспективным является использо-
вание специфических эндонуклеаз — относительно просто организованных белков, отличающихся высокой избирательностью взаимодействия с субстратом, для изучения одной из кардинальных проблем современной молекулярной биологии — механизмов белок-нуклеинового узнавания. Несмотря на очевидную актуальность вышеуказанных исследований, выделению гомогенных препаратов рестриктаз долгое время уделялось значительно меньше внивания, чем вопросам получения функционально очищенных препаратов. Это наглядно иллюстрируется следующим соотношением: из более чем 1000 охарактеризованных рестриктаз, в литературе удалось обнаружить сведения только о 22 ферментах, выделенных в гомогенном состоянии.
С технологической точки зрения процедура выделения гомогенных препаратов в общем случае является более сложной задачей, чем задача получения функционально очищенных ферментов. Для достижения поставленной цели вынужденным является расширение арсенала методических приемов, используемых как в процессе очистки, так и для количественной оценки стадий выделения. Поэтому развитие исследований по выделению гомогенных препаратов рестриктаз следует рассматривать и как «полигон», где отрабатываются новые методические подходы к очистке указанных ферментов, что, несомненно, вносит вклад и в развитие работ по получению функционально очищенных препаратов рестриктаз.
В области препаративной биохимии рестриктаз практически, только в случае выделения гомогенных препаратов этих ферментов описание схем очистки сопровождается количественными данными, позволяющими оценить эффективность отдельных стадий и выход целевого продукта. Приложение усилий для получения таких сведений в определенной степени диктуется и необходимостью подбора эффективных стадий, обеспечивающих получение необходимых количеств гомогенных препаратов рестриктаз. Однако, при оценке схем их получения в целом следует отметить, что в связи с присутствием в бесклеточных экстрактах неспецифических нуклеаз количественное определение активности целевых ферментов во многих случаях оказалось возможным проводить только после частичной их очистки. Это исключает возможность оценки эффективности первых стадий и всей схемы в целом. Тем не менее наличие количественных данных последующих стадиях очистки является полезной информацией, позволяющей оценивать эффективность сорбентов.
Сводные данные о количестве использованной биомассы, абсолютном и относительном выходе ферментов по белку, степени очистки и относительном выходе по активности очищенных до гомогенного состояния рестриктаз представлены в табл. 22.
В таблицу не включена и дальше не рассматривается схема выделения рестриктазы Bst 1503, разработанная Катереллом и Уилкером [70]. При оценке этой работы приходится согласиться
Сводные данные о выходе и степени очистки рестриктаз, очищенных до гомогенного состояния
№ Ростриктаза Количес - Количество гомо Степень Выход, Литера
п/п во сырой генного белка очистки % тура
общее из 1 г
(мг) биомас
сы (мкг)
1. Аху I 260 0,858 3,3 3 500 27 [302]
2. Ah I 150 0,84 0,6 4 000 43,8 299]
3. ВагпН I 500 2,0 4.0 1 750 19а) 254]
4. Bgl I 740 4,0 5.4 --- --- 163]
1 000 3,0 3.0 3806 15,6а 138]
5. Bon I 20 0,8 14.0 1 816 21а) 196]
6. Bgl II 250 1.7 6,8 --- --- 127]
7. BspR I 80 0.4 5,0 2 200 13а) 152]
50 0,4 8,0 1 600 18а) 283]
8. Bst I 70 000 38,0 0.54 1 797 17 [74]
9. Bsu I 70 0,077 1.1 7 100 18.5а [58]
10. GceGL I 170 1,55 9 645 41.7 234]
11. EcoR I 350 0.2 0.6 1 500 3.5 107]
3 200 27,0 8,5 1 180 21 184]
4 730 53,7 11.4 1 750 28 [228]
1000 5.1 5,1 _ __ [15]
12. EcoR V 20 60,0 30 000 --- - [80]
13. EcoR II 300 3.4 11,3 256 10а) [13]
14. Hha II 25 0,75 30.0 327 13а) 140]
15. Нра I 100 0,06 0.6 17 000 34 118]
16. Mva I 15 0.22 14,6 860 32 а 29]
17. Ngo II _ 0.34 _ 38,8 12 72]
18. PaeR7 I 41 12,0 293 11 10 272]
19. Pal I 400 0,21 0,52 1 650 33 33]
