Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
В большинстве случаев выделения гомогенных препаратов рестриктаз для удаления нуклеиновых кислот используется их высаждение при помощи СС или ПЭИ [13, 72, 106, 107, 127, 138, 184, 299, 234], что, учитывая простоту масштабируемости этого приема, является вполне понятным. Имеются примеры использования для разделения нуклеиновых кислот и целевых ферментов на первой стадии препаративных опытов сорбентов, в том числе ФРП [29, 34, 80, 254], гепаринсефарозы [196] голубой сефарозы [33] и ДЭАЭц [74]. В цитированных случаях только в случае выделения Bgl I [163] грубые экстракты перед нанесением на сорбенты подвергались высаливанию.
Высаливание белков нашло применение во многих схемах выделения гомогенных препаратов рестриктаз и за несколькими исключениями [34, 72, 80, 127, 138] проводилось в подобран-
ном ступенчатом режиме [74, 140, 152, 184, 299, 302], позволяющем добиться наряду с концентрированием исследуемых препаратов и их освобождением от ПЭИ [13, 127, 140] или СС [72, 106, 107, 184, 234] и частичной очистки целевых ферментов.
Характерной чертой схем выделения гомогенных препаратов рестриктаз в части, касающейся хроматографических стадий очистки, является увеличение по сравнению с аналитическими опытами среднего их числа и набора используемых средств. Типичными для этих схем является наличие трех [72, 74, 106, 152, 184, 196] — четырех [13, 33, 34, 163, 234, 254] хроматографических стадий. Значительно реже встречаются схемы, включающие две [29, 127] —пять [138, 140] таких стадий. С количественной точки зрения (число хроматографических стадий) разница между препаративными и аналитическими опытами не является принципиальной, что свидетельствует о подборе эффективных схем очистки целевых ферментов. Сравнение качественных параметров (набор используемых сорбентов) технологии получения препаратов рестриктаз, различающихся по уровню очистки, убеждает, что для опытов по получению гомогенных препаратов рестриктаз характерным является увеличение ассортимента используемых средств. Наряду с широким применением в этих экспериментах сорбентов, традиционно используемых для функциональной очистки специфических эндонуклеаз: ФРП [29, 72, 74, 80, 106, 138, 152, 163, 177, 184, 254, 298] и ДЭАЭц [13, 74, 107, 127, 138, 140, 177, 234, 299], относительно чаще встречается ГАП [72, 74, 107, 138, 152, 163, 177, 184, 196, 234, 254] и ГС [33, 127, 140, 177, 234, 299]. На сложность получения гомогенных препаратов указывает и частое использование в препаративных схемах гельфильтрации [13, 33, 74, 106, 107, 138, 299], хроматографии на ДНК-целлюлозе [163, 184, 196, 302] или ДНК-агарозе [152], СП-сефадексе, фенилсе-фарозе, w-аминопентилсефарозе [118, 138, 163, 254], голубой сефарозе [29, 234], карбоксиметилцеллюлозе [106] или ее аналоге Биорексе [254], т. е. частое использование таких сорбентов, которые в схемах выделения функционально очищенных препаратов рестриктаз встречаются значительно реже. Это явление следует рассматривать как выражение тенденции решить поставленную задачу путем поиска стадий, дающих эффективную очистку, т. е. путем включения в схемы выделения сорбентов, различающихся в отношении характера фракционирования исследуемой смеси растворимых клеточных компонентов.
О целесообразности использования более широкого ассортимента сорбентов свидетельствуют некоторые экспериментальные данные. Так, применение на первой хроматографической стадии выделения рестриктазы Hpa I СП-сефадекса, позволило достигнуть исключительно высокой (850-кратной) ее очистки [118]. Введение гельфильтрации на сефадексе Г-100 на последней стадии выделения рестриктазы EcoR I дало 12-кратную
очистку [107]. Эффективным в отношении достигаемой степени очистки оказалось и использование ДНК-агарозы и ДНК, иммобилизованной в полиакриламиде, а также голубой сефарозы на последней стадии выделения рестриктаз Bsp I [152, 283], GceGL I [234] и Mva I [29] соответственно. Представленная в цитированных публикациях информация убеждает о высокой разделяющей способности вышеуказанных сорбентов и говорит о целесообразности их более широкого применения в опытах по получению функционально очищенных препаратов рестриктаз.
Рассмотренные выше примеры требуют некоторого пояснения. Анализируя данные, иллюстрирующие степень очистки целевого белка, следует иметь ввиду, что ее абсолютное значение зависит не только от эффективности сорбента, но и от того на какой стадии очистки он был включен в схему выделения. Особенно это замечание следует иметь в виду, оценивая результаты предпоследних и последних стадий очистки, когда целевой фермент составляет значительную часть в исследуемом белковом препарате. В таком случае использование даже высокоэффективного сорбента не может дать большей степени очистки, чем кратная доля выделяемого фермента в поступившем на него белковом препарате.
В опытах по получению гомогенных препаратов рестриктаз, как уже отмечалось, широко используется ФРП и ДЭАЭц — сорбенты, нашедшие применение в большинстве схем выделения функционально очищенных препаратов этих ферментов. Наличие количественных данных о выходах и степени очистки, достигаемой с использованием этих ионитов в препаративных опытах, убеждает в высокой эффективности хроматографии на ФР II, в основном использованной на первых стадиях очистки. Сказанное подтверждают данные о достижении при хроматографии на ФРП 10-ти кратной [74, 152], 40-кратной [107, 184, 228], 50-ти кратной [154], 100-кратной [29] и даже 226-ти кратной [58] очистки. Потери целевых ферментов во всех случаях не превышали половины, а в некоторых составили менее 20% [184, 283]. Для применения ДЭАЭц, включаемой в схемы очистки гомогенных рестриктаз в основном на предпоследних стадиях, характерна степень очистки, равная 1,3—6-кратной [13, 58, 118, 138, 302]. Только в нескольких случаях достигаемая степень очистки была близкой к 10-ти кратной [72, 177], а в случае рестриктазы АН I равнялась 23-кратной [299]. За исключением последнего случая, высокоэффективная очистка (более чем десятикратная) сопровождалась большими (60—90%) потерями целевых ферментов [72, 177]. Аналогичные, как и в случае ДЭАЭц, показатели в отношении достигаемой степени очистки характерны и для применения (в основном на предпоследних стадиях очистки) хроматографии на ГАП [72, 107, 118,
