Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Имеются немногочисленные примеры применения для разделения нуклеиновых кислот и другого сорбента, содержащего катионообменные группы в составе лиганда цибакрона синего F3GA — голубой сефарозы, впервые примененной с этой целью Бекси с соавт. [32], для очистки четырех рестриктаз: BamH I, Pall, Xho I и Bgl I+П. В этих опытах грубые экстракты продуцентов указанных ферментов наносили на сорбент при низкой ионной силе. Нуклеиновые кислоты и значительная часть
неспецифических нуклеаз не задерживались голубой сефаро-зой, что позволило согласно утверждению авторов при последующей элюции градиентом концентрации соли получить довольно высокоочищенные препараты вышеуказанных ферментов, пригодных для специфического фрагментирования ДНК. Авторами цитированной работы было выдвинуто логичное предположение о приемлемости разработанной процедуры и в случае проведения первой стадии очистки других рестриктаз. Однако этот прогноз был подтвержден в единичных опытах [18] и обсуждаемый метод разделения нуклеиновых кислот и целевых ферментов распространения не получил. Возможно, что причиной этому является низкая емкость голубой сефаро-зы к рестриктазам, сорбируемым из грубых экстрактов [102], а также необходимость вести сам процесс из растворов низкой ионной силы [32]. Последнее условие вносит определенные ограничения на использование голубой сефарозы для обсуждаемых целей.
В завершение обсуждения методических приемов, используемых для разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз, хотелось бы обратить внимание на некоторые вопросы. Взаимодействие рестриктаз и нуклеаз — основных интересующих исследователя компонентов грубого экстракта, с нуклеиновыми-кислотами, вносит ощутимый вклад в результаты экспериментов. Использование высокой ионной силы позволяет исключить-этот фактор в случае гельфильтрации и высаждения нуклеиновых кислот при помощи ПЭИ. Однако в этих условиях в общем случае должен наблюдаться переход во фракцию, содержащую рестриктазы, неспецифических нуклеаз. Поэтому, если цель эксперимента сводится не просто к разделению нуклеиновых кислот и рестриктаз, а к определенной функциональной очистке целевого фермента, более привлекательным является использование таких приемов, которые позволяют варьировать ионную силу. Перспективным в этом отношении является применение катионитов. При взаимодействии грубых экстрактов с катионитами нуклеиновые кислоты в общем случае должны оказаться в несорбированной фракции. Проведение процесса в условиях низкой или умеренной ионной силы призвано обеспечить удаление вместе с нуклеиновыми кислотами и определенной части иеспецифических нуклеаз. Хотя это специально и не оговорено, данные об эффективной функциональной очистке более десяти рестриктаз по схеме, разработанной Грин с соавт. [109], прошедших, вслед за стадией фракционирования грубых экстрактов на ФРП, хроматографию на ГАП, косвенно подтверждает это предположение.
Одним из путей реализации потенциальных возможностей хроматографических способов, позволяющих совместить в одной стадии гарантированное отделение нуклеиновых кислот и высокоэффективную очистку целевых ферментов, видится во введе-
нии в практику препаративной биохимии рестриктаз новых избирательных в этом отношении сорбентов. В результате проведенных исследований была продемонстрирована эффективность и перспективность применения для обсуждаемых целей гепаринсефарозы [30, 111, 196].
Удаление нуклеиновых кислот в некоторых случаях сопровождается заметной функциональной очисткой целевых ферментов [32, 109, 263]. Однако, по вполне понятным причинам выделение рестриктаз на этом этапе не завершается и для получения препаратов заданного уровня чистоты необходимо использование дополнительных приемов. Они будут рассмотрены в следующем разделе.
3.3. Методы, используемые для очистки рестриктаз
Во многие схемы очистки рестриктаз вводится стадия высаливания белков сернокислым аммонием. С применением этой процедуры решаются многие задачи: очистка, концентрирование разбавленных растворов, отделение рестриктаз от СС и ПЭИ. Так Муррей с соавт. [188] подобрали условия эксперимента, позволяющие разделить на этой стадии рестриктазы Ava I и Ava II, выделяемые из одной биомассы, которые переходили в осадок при 20—40% и 50—70% насыщении бесклеточного экстракта A. variabilis сернокислым аммонием соответственно. Примером другого варианта фракционирования высаливанием является работа Модрича и Забелы [184], где была использована экстракция белкового осадка, полученного при 70% насыщении грубого экстракта Е. coli RY13 солью, растворами со ступенчато понижающейся концентрацией сернокислого аммония. В результате проведения такой процедуры удалось повысить удельную активность целевого фермента в 2,7 раза. Фракционное высаливание белков нашло применение в схемах очистки многих рестриктаз [74, 98, 115, 118, 140, 142, 152, 173, 235, 247, 248, 296 и др.].
Высаливание часто применяется для концентрирования разбавленных растворов, содержащих рестриктазы, что может оказаться актуальным после проведения стадии удаления нуклеиновых кислот с использованием гельфильтрации [113, 152,
