Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Янулайтис А.А. -> "Биотехнология. Том 17" -> 88

Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.

Янулайтис А.А. Биотехнология. Том 17 — Москва, 1989. — 204 c.
Скачать (прямая ссылка): fermentiserekteciiiihpremenenie1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 82 83 84 85 86 87 < 88 > 89 90 91 92 93 94 .. 107 >> Следующая

В развитии косвенных методов определения сайтовой специфичности основную роль сыграло: (1) появление большого числа охарактеризованных рестриктаз и накопление данных об основных типах построения узнаваемых участков, (2) установление первичной структуры ДНК ряда небольших вирусов и плазмид, (3) использование вычислительной техники.
Стремительный рост числа новых рестриктаз и определение основных типов их субстратной специфичности [183] привел к появлению самого простого из косвенных методов, так называемого метода визуального сравнения, сущность которого заключается в сопоставлении результатов расщепления одного и того же субстрата известной и исследуемой рестриктазами. Так как при действии какой-либо рестриктазы на индивидуальную ДНК образуется характерный набор рестриктов, то в случае совпадения картин их электрофоретического разделения (ре-стриктограмм), делается вывод об идентичной специфичности этих ферментов. Иногда применение этого метода сводится к сравнению полученной рестриктограммы с таковыми, представленными в каталожных изданиях [189]. Очевидно, что настоящий метод пригоден только для характеристики аналогов уже известных рестриктаз (изошизомеров). Следует однако отметить, что такая оговорка недействительна в случае впервые обнаруженных рестриктаз с палиндромной сайтовой специфичностью, так как все варианты предполагаемого электрофоретического распределения фрагментов в этом случае рассчитаны на ЭВМ и в графическом виде представлены в справочной литературе [190].
Параллельно и в дополнение к методу визуального сравнения широко используется метод картирования ДНК. Метод, широко используемый в молекулярной генетике, нашел свое применение в исследованиях специфичности рестриктаз благодаря определению первичной структуры ряда ДНК-стандартов — небольших фагов и плазмид [39, 212, 231, 232, 266]. Визуальное сравнение нуклеотидных последовательностей в картированных районах в большинстве случаев позволяет обнаружить гомологические последовательности и тем самым определить узнаваемые участки. Если на этапе сравнения экспериментально полученной рестриктограммы с каталожными или расчетными иллюстрациями, сделано предположение о сайтовой специфичности исследуемого фермента, то для его подтверждения может быть также использован метод картирования. В этом случае предполагаемые координаты расщепления субстрата исследуемой рестриктазой бывают известны и поэтому величины и число фрагментов совместного расщепления с какой-либо известной рестриктазой можно получить расчетным путем. Совпадение расчетных и экспериментальных данных будет указывать на правильность предварительного вывода.
Другой важной вехой в области исследования специфично-
сти рестриктаз были разработанные Фуксом с соавт. [96, 97] таблицы частоты встречаемости палиндромных тетрануклеотид-ных-гексануклеотидных последовательностей в ДНК некоторых вирусов, фагов и плазмид. Для этих стандартных ДНК было определено число каждого из палиндромных сайтов а также расстояния между ними. Таким образом, экспериментально определяется только частота расщепления исследуемым ферментом нескольких стандартных ДНК и, в случае необходимости, их величины. В дальнейшем эти данные сравниваются с таковыми представленными в таблицах [96, 97]. В большинстве случаев этих данных бывает достаточно, чтобы предсказать сай-товую специфичность исследуемого фермента.
В настоящее время разработаны программы для микро-ЭВМ, позволяющие быстро картировать любые нуклеотидные последовательности в различных ДНК-субстратах. Для этой цели используются как централизованные банки ДНК, так и собственные нуклеотидные последовательности. Такие программы позволяют не только картировать определенные точки, но и определить в картированных районах гомологические участки, что оказывается крайне полезным в случае более сложных вариантов сайтовой специфичности.
Резюмируя накопленный опыт можно рекомендовать следующую тактику применения косвенных методов (они даются в порядке методического усложнения) для предсказания структуры участка узнаваемого исследуемым ферментом: 1) визуальное сравнение электрофореграмм продуктов расщепления ДНК фага % исследуемым ферментом с аналогичными литературными данными относительно известных рестриктаз; 2) определение частоты расщепления и величин генерируемых фрагментов нескольких стандартных субстратов (ДНК pBR322, ФХ174, fd, SV40) с установленной первичной структурой (39, 212, 232, 266] и сравнение полученных данных с табличными [96, 97]. После того, как была установлена первичная структура ДНК фага X [231], большим подспорьем в таких экспериментах явились аналогичные таблицы, составленные для этого субстрата А. Мироновым (ВНИИ Генетика); 3) картирование местоположения сайтов расщепления на вышеуказанных ДНК и поиск общих ¦последовательностей в их окружении.
Очевидно, что для предсказания специфичности конкретного исследуемого фермента зачастую нет необходимости в использовании все вышеперечисленных приемов. Иногда для достижения поставленной цели оказывается достаточным применить один или два из них.
Предыдущая << 1 .. 82 83 84 85 86 87 < 88 > 89 90 91 92 93 94 .. 107 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed