Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
В случае использования биологических методов, как следует из приведенных выше примеров, огромное число штаммов исключается из круга исследуемых уже на первых стадиях проверки. Биохимической проверке доступны все штаммы. Однако, и в этом случае существует множество причин, по которым имеющиеся в клетках специфические эндонуклеазы могут быть не обнаружены. Вряд ли все их можно предусмотреть и перечислить. Среди очевидных причин видимого отсутствия искомой активности (кроме упомянутого выше отсутствия сайтов узнавания в субстрате) в опытах in vitro можно перечислить следующие: отсутствие сайтов узнавания может иммитировать-ся природными модификациями субстратов как в виде метилирования, так и более сложными ее вариантами [19, 155]. Предположительно часть рестриктаз может инактивироваться в ходе получения бесклеточных экстрактов или маскироваться присутствием большой, относительно рестриктазной, активностью неспецифических нуклеаз. Несмотря на исключительно высокую чувствительность электрофоретического метода [241]^ из-за маскирующего действия нуклеаз она может только снизиться. Проявление последнего фактора особенно должно сказаться на обнаружении рестриктаз, содержащихся в клетках в незначительных количествах. Состав рестрикционных смесей, используемых для определения активности рестриктаз в опытах по их поиску, может оказаться далеко не оптимальным. В ка-
честве кофактора в реакционной смеси обычно добавляются только ионы магния. Не исключено существование в природе специфических эндонуклеаз, имеющих другие кофакторные потребности. Такие ферменты в общепринятых для поиска рестриктаз реакционных смесях заведомо не будут тестироваться.
В принципе существуют методические подходы, позволяющие хотя бы частично проверить возможное влияние некоторых из вышеперечисленных факторов на наблюдаемый отрицательный результат путем вариации условий экспериментов. Однако осуществление таких опытов в большинстве случаев связано с выполнением многочисленных и трудоемких экспериментов.
В поиске путей решения вышеперечисленных вопросов определенный вклад могут внести биологические методы поиска СХС. Известны случаи, когда достоверно биологическими методами доказано существование СХС, но определить эндонукле-азную активность in vitro не удается [81, 150, 265]. Причины этого явления могут быть тривиальными (например, инактивация ферментов в бесклеточных экстрактах) или более сложными (потребность в неизвестном кофакторе (—ах)). Целенаправленное изучение причин этого явления могло бы способствовать поиску подходов в решении проблемы «тестируемости» хотя бы части рестриктаз биохимическими методами.
3. ОЧИСТКА РЕСТРИКТАЗ
Очищенные препараты рестриктаз необходимы как для их характеристики, так и для использования в качестве аналитических реагентов в различных сферах применения этих ферментов. Выделение рестриктаз, как и любых других ферментов, преследует две цели — получение ферментных препаратов, свободных от нежелательных примесных активностей (функциональная чистота), или получение гомогенных белков (физическая чистота). В случае специфических эндонуклеаз в качестве нежелательных примесей в первую очередь выступают неспецифические нуклеазы и фосфатазы, имеющиеся во всех клетках, а иногда и рестриктазы, присутствующие наряду с целевым ферментом в биомассе некоторых продуцентов.
Требования к уровню функциональной чистоты препаратов рестриктаз, используемых в опытах по определению их субстратной специфичности, далеко не одинаковы и диктуются заданной глубиной исследования этой характеристики. В случае применения рестриктаз в качестве аналитических реагентов качество препаратов, в зависимости от сферы применения, тоже может варьировать. В опытах по физическому картированию допустимо использование ферментов, содержащих в качестве примесей нелимитированное количество фосфатаз. Уровень присутствия неспецифических нуклеад ограничивается та-
ким их содержанием в препаратах рестриктаз, который бы не искажал картины распределения фрагментов на электрофоре-грамме. Рестриктазы, используемые в опытах по генной инженерии и секвенированию ДНК, должны характеризоваться очень высокой функциональной чистотой. Для изучения ряда физико-химических и энзиматических свойств рестриктаз, а также исследования механизмов их взаимодействия с ДНК необходимы гомогенные препараты этих ферментов.
Преобладание прикладных аспектов в исследованиях, посвященных ферментам рестрикции, находит свое отражение и в том, что в опытах по препаративному получению специфических эндонуклеаз основные усилия направлены на выделение функционально очищенных их препаратов. Значительно меньше внимания уделяется получению этих ферментов в гомогенном состоянии.
Рассмотрение известных схем выделения рестриктаз сталкивается с определенными трудностями. Отличительной чертой препаративной биохимии специфических эндонуклеаз по сравнению с традиционной практикой выделения многих других ферментов, является скудность количественных данных, характеризующих степень очистки и выход целевого продукта как на отдельных стадиях, так и после реализации всего процесса выделения, т. е. отсутствие критериев, обычно используемых для эффективности схемы очистки. Не принято проводить и оценку степени функциональной очистки на всех стадиях выделения, а тем более в многочисленных фракциях, собираемых в результате проведения хроматографического процесса. Такому анализу обычно подвергается только конечный препарат.
