Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Другой более простой вариант указанного подхода был использован Глатман с соавт. [8], задавшимся целью выявления и изучения систем рестрикции-модификации, детерминируемых трансмиссибельными плазмидами клинических изолятов Е. coli. Для выявления СХС, контролируемых этими плазмидами, осуществляли их конъюгативный перенос в производные лабораторного штамма Е. coli К12 и определяли эффективность посева Xvir на трансконъюгатах и изогенных безплазмидных штаммах. В случае снижения эффективности посева устанавливалось наличие модификации общепринятыми методами, заключающимися в попеременных пассажах Xvir на ограничивающих рост фага трансконъюгатах и контрольных штаммах. Всего было исследовано 450 клинических изолятов Е. coli, среди которых 260 оказались антибиотикоустойчивыми. Из них 101 содержал трансмиссибельные R плазмиды. 30 трансконъюгатов ограничивали развитие тестерного фага, но только в 10 случаях это было связано с проявлением систем рестрикции-модификации. 9 этих систем оказались идентичными известной СХС EcoR II {8]. Один трансконъюгат Е. coli J62pLG74 обладал СХС, отличной от описанных ранее систем, контролируемых R плазмидами, которая была названа EcoRV. Применение биохимических методов дало возможность выделить специфическую эндодезоксирибонуклеазу, известную под этим же названием [28]. Обсуждаемая работа является частным случаем поиска СХС, а именно СХС, контролируемых трансмиссибельными R плазмидами. Применение такого подхода облегчает решение ряда методических вопросов, так как эффективность посева изучается на трансконъюгатах, созданных на базе хорошо изученных лабораторных штаммов, охарактеризованных в отношении их взаимодействия с тестерными фагами. С методической точки зрения это является одним из самых простых вариантов поиска СХС биологическими методами. Однако, да-
же в этом случае видно, какое большое число штаммов по методическим причинам исключается из рассмотрения, а ее результативность во многом определяется вероятностью одновременной локализации генов лекарственной устойчивости и СХС в трансмиссибельных плазмидах.
Рассмотрение вышеуказанных частных примеров поиска СХС биологическими методами убеждает в том, что несмотря на их простоту, они отличаются громоздкостью и низкой результативностью.
С учетом вышеуказанного становится очевидным, что применение биологических методов, как предварительного этапа поиска специфических эндонуклеаз, особенно в отношении природных штаммов, имеет ограниченное значение. Тем не менее, этот подход внес определенный вклад в расширение списка специфических эндонуклеаз и можно прогнозировать, что и в будущем некоторое число указанных ферментов будет выявлено обсуждаемым способом.
В завершении обсуждения биологического подхода следовало бы подчеркнуть, что он в принципе неприемлем для целенаправленного поиска рестриктаз II типа. Этим способом отбираются СХС без учета их энзиматической основы. Как известно, в ограничении развития фагов участвуют и рестрикционные эндонуклеазы I и III типов. Поэтому неизбежным этапом идентификации типа и субстратной специфичности рест-риктирующего компонента обнаруженной новой СХС является его исследование биохимическими методами.
2.2. Биохимические методы поиска продуцентов специфических эндонуклеаз
Начало применения биохимических методов для поиска и идентификации специфических эндонуклеаз относится к опытам, завершившимся открытием первой рестриктазы II типа — Hind II [253]. В этих экспериментах было обнаружено, что ДНК салмонельного фага Р22, в отличие от хромосомной ДНК
Н. influenzae Rd, деградируется бесклеточным экстрактом указанного штамма. Это было продемонстрировано путем ультрацентрифугирования продуктов реакции в градиенте сахарозы и с использованием вискозиметрического метода.
Использование этих приемов, позаимствованных из методического арсенала определения активности рестриктаз I типа [181], способствовало открытию ряда других первых специфических эндонуклеаз [110, 182, 244]. Несмотря на успешное применение ультрацентрифугирования и вискозиметрического метода, сразу стало очевидным их принципиальное ограничение, выражающееся в том, что эти методы регистрируют любую эн-донуклеазную активность и, таким образом не являются изби-
рательными по отношению к специфическим эндодезоксирибонуклеазам. Этими недостатками не обладал электрофоретический метод [241], первоначально предложенный для определения активности рестриктаз в ходе их очистки, который оказался очень удобным для тестирования наличия специфических эндонуклеаз в бесклеточных экстрактах исследуемых культур. Применение обсуждаемого метода впервые дало возможность вести целенаправленный широкомасштабный поиск этих ферментов и во многом способствовало развитию этих исследований. Подавляющее большинство известных в настоящее время специфических эндонуклеаз было открыто используя именно этот подход.
Большим достоинством обсуждаемого метода является возможность его использования для тестирования активности специфических эндонуклеаз, несмотря на присутствие некоторых количеств неспецифических эндонуклеаз. Эта особенность электрофоретического метода способствует быстрой проверке многих штаммов. Однако, в таких опытах наблюдаются и случаи относительно большого содержания неспецифических нук-леаз в бесклеточных экстрактах некоторых исследуемых культур, что может маскировать активность целевых ферментов и тем самым препятствовать их выявлению [179].
