Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Рейсер и Юан [214] предложили использовать в качестве субстрата кольцевые ДНК молекулы фага % (кольца Херши). Для разделения субстрата и продуктов рестриктазной реакции их раствор пропускали через нитроцеллюлозные фильтры. Свойство нитроцеллюлозы в определенных условиях связывать только кольцевые ДНК молекулы позволило отделить продукты реакции и субстрат. Последующее измерение количества связанной с фильтрами радиоактивной ДНК служило мерой рестриктазной активности. Аналогичный принцип определения активности исследуемых ферментов был апробирован Дефилли-пес-сом [86]. В этом случае для разделения субстрата — плазмидной кольцевой ДНК и продуктов реакции был применен гидро-ксиапатит.
Другой вариант количественной оценки разрыва ДНК реализовали Модрич и Забела [184], использовавшие в качестве субстрата ДНК плазмиды ColE I. Указанные авторы ввели в реакционную смесь эндонуклеазу гесВС, которая действовала только на линейную ДНК (продукт рестриктазной реакции) и переводила ее в кислото-растворимую фракцию, содержание метки в которой отражало активность рестриктазы EcoR I.
Грин с соавт. [106] для определения активности этого же фермента, наряду с ДНК вируса ОВ40, в качестве субстрата использовали синтетический октануклеотид, меченный 32Р, содержащий участок, узнаваемый этим ферментом. Измерение содержания метки в продуктах реакции, разделенных методом электрофореза на бумаге, позволило количественно оценивать активность исследуемого фермента.
Определение активности рестриктаз, основанное на использовании кольцевых ДНК молекул [106, 107], применимо
только к некоторым ферментам, для которых удается подобрать сравнительно небольшого размера субстраты, содержащие ограниченное число точек расщепления. Иначе говоря, в каждом конкретном случае попытка использования вышеуказанных методов предполагает поиск доступного субстрата, удовлетворяющего вышеуказанным требованиям. Более общий подход к количественной оценке рестриктаз был предложен Беркнером и Фолком [40, 41]. С этой целью ими была использована способность полинуклеотидкиназы Т4 катализировать в определенных условиях обмен 5’-фосфата в молекулах ДНК на '|‘ФосФат АТФ [40]. Соответствующими опытами было продемонстрировано, что количество введенной в рестрикты метки из fr-32?]-АТФ пропорционально содержанию ДНК концов, образовавшихся в результате действия рестриктаз на субстрат. Метод оказался приемлемым для определения активности ферментов рестрикции, образующих как 5’ или 3’ выступающие, так и полностью спаренные концы ДНК на месте ее расщепления.
Все рассмотренные количественные методы определения активности рестрикционных ферментов выполняются путем отбора проб в ходе реакции и их анализа. Халфордом и Джонсоном [114] был предложен и реализован на примере REcoR I непрерывный способ регистрации кинетики реакции. Он основан на разной способности связывать этидиум бромид сверх-скрученной и никированной формами кольцевых молекул ДНК. Это приводит к изменению флуоресценции, что и регистрируется при помощи флуориметра.
Резюмируя рассмотрение количественных методов определения активности рестриктаз, следует отметить, что они являются адекватными приемами для изучения кинетических параметров катализируемых этими ферментами реакций. Несомненно, что в аналогичных опытах они найдут применение и в будущем. Однако, их использование в таких экспериментах, как, например, очистка рестриктаз и изучение влияния условий культивирования на содержание целевых предметов в биомассе, является малопривлекательным. Это, кроме отмеченных выше ограничений, выражающихся в необходимости подбора в каждом конкретном случае подходящих субстратов, обуслов-ленно трудоемкостью приготовления таких субстратов (это замечание особенно касается радиоактивных субстратов) и анализа продуктов реакции. На всех этих этапах необходимо располагать уникальной аппаратурой и возможностью работать с изотопами. Хотя часть из обсуждаемых методов и была использована в единичных опытах по очистке рестриктаз [106, 163, 184, 254,], по вышеизложенным причинам они распространения не получили. Их трудоемкость является очевидной, а выигриш в точности определения в таких опытах по сравнению с электрофоретическим методом не окупает затрат.
Вышеупомянутыми недостатками не обладает спектрофото-
метрический метод [134], нашедший, применение в экспериментах по очистке рестриктаз [29, 196]. В качестве субстрата используется нативная ДНК иммобилизованная на целлюлозе. Под воздействием рестриктаз ДНК высвобождается с матрицы. Измерение оптической плотности растворов, содержащих продукты реакции, при длине волны равной 260 нм, позволяет количественно в условных единицах оценивать активность исследуемых ферментов. Продемонстрирована применимость обсуждаемого метода для количественного определения активности рестриктаз самой различной специфичности [29, 134, 196]. Этот метод отличается простотой и требует для своего использования несложной аппаратуры. Спектрофотометрический метод нашел применение в ходе разработки и реализации схем очистки ряда рестриктаз [29, 196].
