Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Известен другой количественный метод определения активности рестриктаз, тоже основанный на применении иммобилизированной ДНК [229]. Однако в последнем случае используется радиоактивная ДНК заполимеризованная в полиакриламидном геле. Этот метод уступает спектрофотометрическому в универсальности, так как он применим только к частощепящим рестриктазам. Кроме того его применение связано с использованием радиоактивного субстрата.
Как уже отмечалось (и это имеет принципиальное значение), электрофоретический метод позволяет в одном опыте, путем рассматривания гелей, дифференцировать специфическую и неспецифическую нуклеазные активности и наличие нескольких рестриктаз. Конечно, рассмотренные выше количественные методы после соответствующих их модификаций можно адаптировать и для решения таких задач. Однако, это еще более усложнило бы их применение. Поэтому в опытах по поиску продуцентов рестриктаз и в значительной мере в экспериментах по их очистке электрофоретический метод не имеет себе равных.
2. ПОИСК ПРОДУЦЕНТОВ РЕСТРИКТАЗ
Основная масса известных специфических эндонуклеаз была обнаружена в результате целенаправленного применения для их поиска биохимических методов тестирования, основанных на определении способности грубых или частично очищенных бесклеточных экстрактов исследуемых культур специфически фрагментировать ДНК субстраты. Значительно меньшее число этих ферментов было выявлено благодаря изучению энзиматических основ систем хозяйской специфичности (СХС) прокариотических микроорганизмов, реализовавшихся в открытии рестриктаз II типа. В последнем случае таким опытам предшествовали генетические (биологические) эксперименты по определению наличия и изучению генетического контроля систем
рестрикции-модификации у прокариотических микроорганизмов классическими методами, основанными на определении эффективности посева тестерных фагов на исследуемых и контрольных штаммах.
2.1. Биологические подходы к поиску продуцентов рестриктаз
По ряду причин, которые будут рассмотрены ниже, биологический подход, в отличие от биохимического, для целенаправленного поиска продуцентов специфических эндонуклеаз за редкими исключениями не применялся и их выявление оказалось как бы «побочным» продуктом исследований, посвященных отдельным аспектам поиска и изучения СХС. Среди таких исследований, имевших различные первоначальные цели, предшествовавших открытию рестрикционных эндонуклеаз II типа, находим эксперименты, посвященные изучению распространению и характеристики СХС в различных таксономических группах микроорганизмов [24, 25, 186, 242], механизмов ограничения развития фагов R плазмидами [8, 129, 300] и факторов, влияющих на исход опытов по фаготинировашуа [258]. В некоторых случаях первопричиной таких опытов было стремление выбрать не обладающие СХС базовые штаммы некоторых новых объектов с целью их использования как реципиентов рекомбинантных молекул ДНК в опытах по генетической инженерии. Примером таких работ является изучение наличия и специфичности систем рестрикции—модификации в штаммах стрептомицетов [6] и цианобактерий [91].
Указанные выше исследования послужили предпосылкой для открытия рестриктаз II типа; EcoRI и EcoRII из штаммов-Е. eoliRY13 и R245 соответственно [330, 301], EcoRV [28] — Е. coli J62pLG74 [8], EcoCK [1] — Н. eoliCK [25], Sso47 н Sso47 II [18] — Shigella Sonnei47 [25, 26], Pae37 I [119] — Pseudomonas aeruginosa [129], Sau3A I и Sau96I в штаммах Staphylococcus aureus3A [264] и 96 [265] соответственно, BsuM I [136] BsuR I [59] в штаммах Bacillus subtilis 168 [242J и R [275] соответственно, Bst I [70] из Bacillus stereothermophil-lus 1503—4R [69], BamN I [243] и BamH I [296] в штаммах Bacillus amyloliquefaciens N и H [242] соответственно, Shy I [287] — Streptomyces hygroscopicus 0477 [24], Sgr II [20] — Streptomyces griseus Kr20 [6], NspB I и NspB II, NspH I и NspH II из Nostoc sp. В и H соответственно [91], Avr I и Avr II [216] из Arabaena variabilis [79], ScrF I [95] — Streptococcus craemoris F [81], MviV2 I и MviV2 II из Mixococcus virescens V2 [186]. Этим списком, включающим 25 наименований, практически исчерпывается перечень ферментов, для которых удалось четко определить последовательный ход экспериментов, начавшихся с выявления систем рестрикции-модификации биологическими методами и
завершившихся идентификацией специфических эндонуклеаз биохимическими методами. Учитывая тот факт, что в настоящее время известно более 1000 рестриктазы, вклад биологических методов в пополнение списка этих ферментов следует признать незначительным. Причины этого явления скрываются в ограниченных возможностях обсуждаемого подхода в сфере целенаправленного широкомасштабного поиска специфических эндонуклеаз. Иллюстративной в этом отношении является работа В. Н. Крылова и А. Т. Карапетян [16], одна из немногих, где ставилась цель определить вероятность обнаружения новых вариантов рестрикции-модификации среди природных штамммов и оценить трудности и возможности таких исследований.
