Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Существует несколько объективных причин наблюдаемого явления. В первую очередь это связано с тем, что в начальных стадиях очистки наличие в исследуемых препаратах примесных неспецифических нуклеаз не позволяет, за редкими исключениями, проводить количественную оценку активности рестриктаз. Но даже в случае потенциальной возможности такой оценки, отсутствие простых методов для ее осуществления не способствует проведению обсуждаемого анализа. Количественная оценка примесных неспецифических нуклеаз (особенно эндонуклеаз) тоже встречается с методическими трудностями.
Наиболее широко в опытах по выделению рестриктаз применяется электрофоретический метод [241], использование которого позволяет идентифицировать фракции, содержащие основную массу целевого фермента, и визуально оценить наличие примесей неспецифических нуклеаз. Учитывая тот факт, что основным направлением препаративной биохимии рестриктаз является получение небольших количеств функционально очищенных их препаратов, применение качественного метода (электрофоретического) является вполне оправданным. Однако,
повсеместное применение такого методического подхода не-позволяет на основе литературных данных, за редкими исключениями, оценить эффективность отдельных стадий оичстки и тем более сравнить с этой точки зрения разные схемы выделения рестриктаз. Указанные исключения в основном относятся к опытам по получению гомогенных препаратов этих ферментов.
Источником специфических эндонуклеаз являются штаммы микроорганизмов, каждый из которых, учитывая исключительную пестроту таксономической их принадлежности (см. разд. 2, I-ая часть), в общем случае содержит уникальную композицию белков и других растворимых клеточных компонентов. Рестриктазы a priori отличаются по физико-химическим свойствам. Это утверждение предположительно справедливо и в отношении многих изошизомеров. Поэтому очевидно, что в общем случае выделение и очистка каждого отдельно взятого фермента является индивидуальной задачей. Однако, рассмотрение литературных данных позволяет выделить некоторые общие используемые с этой целью методические приемы.
Основными этапами выделения любой рестриктазы является получение бесклеточных экстрактов и собственно очистка целевых ферментов, осуществимая с применением традиционных приемов препаративной биохимии белковых соединений (высаливание, хроматографическое фракционирование и т. д.). Вместе с тем следует отметить, что процессам выделения рестриктаз, как и других ферментов нуклеинового обмена, характерен ряд специфических особенностей. В первую очередь это замечание относится к тому вниманию, которое уделяется разделению целевых ферментов и нуклеиновых кислот, в принципе способных влиять на перераспределение как рестриктаз, так и нуклеаз между фракциями, получаемыми в результате применения различных методов выделения целевых ферментов. Поэтому этот этап является одним из ключевых в схемах выделения рестриктаз, от результатов проведения которого во многом зависит успех дальнейшей их очистки.
Все этапы выделения рестриктаз (в том числе и центрифугирование гомогената разрушенных клеток), в зависимости от условий их проведения, могут дать в той или иной мере выраженную очистку целевых ферментов. Это замечание относится и к методам, применяемым для разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз. Однако, в связи с отмеченной выше важностью этой процедуры для препаративной биохимии обсуждаемых ферментов по методологическим соображениям уместным является ее рассмотреть отдельно.
С учетом вышеуказанного в качестве основных этапов выделения рестриктаз будут рассмотрены следующие: получение бесклеточных экстрактов, разделение нуклеиновых кислот и целевых ферментов и хроматографическая очистка последних.
3.1. Получение бесклеточных экстрактов
В подавляющем большинстве случаев в опытах по выделению рестриктаз для разрушения клеток используется ультразвук [31, 100, 106, 126, 152, 186, 218, 219, 249, 288]. Иногда
клетки перед этим обрабатывают лизодимом [20, 28, 31, 123, 126, 146, 152] или лизостафином [264, 265]. Реже поставленная цель достигается при помощи Френч пресса [89, 169, 235, 289]. Имеются указания на использование в единичных случаях растирания клеток со смесью алюминия [113] и разрушение при помощи стеклянных шариков [88, 180].
В тех случаях, когда выделение рестриктаз ведется из сотен грамм или килограммовых количеств биомассы, для разрушения клеток применяются экструзионные механические дезинтеграторы [47, 74, 125, 138, 184, 188, 254].
Для экстракции рестриктаз, расположенных в периплазма-тическом пространстве грамотрицательных клеток, был апробирован их осмотический шок [179, 251], что нашло применение при разработке схемы очистки рестриктазы Pst I [251]. В дальнейшем этот метод в препаративных работах по выделению рестриктаз не получил распространения, что, учитывая ограниченный выход целевых ферментов в раствор [251] и относительную трудоемкость обсуждаемой процедуры, является вполне объяснимым.
Следующим этапом получения бесклеточных экстрактов является центрифугирование клеточных гомогенатов. Обычно с этой целью используется высокоскоростное центрифугирование (10 000—50 000 xg 15—60 мин) [10, 100, 123, 125, 188, 296], обеспечивающее удаление клеточных обломков или ультрацентрифугирование, при 100 000 xg в течение 1—2 часов [78, 101, 149, 156, 179, 202, 218, 219, 235, 241 и др.], позволяющее наряду с удалением клеточных обломков перевести в осадок и рибосомы [198]. В доступной литературе имеется несколько примеров ультрацентрифугирования бесклеточных экстрактов при 250 000 xg 17 часов, примененного в случае выделения рестриктаз Nci I и Nde I [292, 293]. Очевидно, что в последнем случае достигается большая очистка целевых ферментов по сравнению с центрифугированием гомогената разрушенных клеток в других вышеуказанных режимах. Ультрацентрифугирование в режиме, обеспечивающем удаление рибосом, применяется довольно часто, что находит объяснение в достижении некоторой очистки целевых ферментов.
