Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
7.3.1. Фосфатные группы
Электростатические контакты рестриктаз BamH I, EcoR I и некоторых других ферментов с фосфатными группами участка узнавания играют существенную роль в фермент-субстратном взаимодействии [396]. Этот вывод подтверждается обнаружением в активных центрах ферментов положительно заряженных аминокислотных остатков лизина и аргинина.
В литературе довольно подробно исследовано взаимодействие рестриктаз EcoR II, Mva I, BamH I и SsoII с фосфатными группами участка узнавания. Их функция изучалась при помощи олигонуклеотидов в которых фосфодиэфирная связь разорвана, фосфатная группа отсутствует или она же заменена на негидролизуемые фосфоамидную [10, 19, 42, 407], пирофос-фатную [29, 407, 419] и метилфосфатную группировку [45] или этилендиаминовый фрагмент [29].
Замена гидролизуемой фосфодиэфирной связи на фосфоамидную (в случае REcoR II) и пирофосфатную (в случае RMval) приводит к полному блокированию расщепления модифицированной цепи гетеродуплекса указанными выше ферментами [29].
Фосфатная группа Т цепи (5'+CCpTGG) важна для формирования контакта с рестриктазами EcoRII и SsoII, на что указывает отсутствие расщепления обеих цепей субстрата с введенной в это положение пирофосфатной связи, а также этилен-диаминовой вставки [29]. В случае рестриктазы Mva I блокируется расщепление только модифицированной цепи, что позволяет делать вывод о том, что для рестриктаз EcoR II и Sso II [29, 30, 407] эта фосфодиэфирная связь более важна, чем для RMva I.
Роль фосфатной группы А цепи (5'+CCpAGG) во взаимодействии с EcoR II изучалась также путем сопоставления данных гидролиза субстрата, содержащего разорванную фосфодиэфир-ную связь в указанном положении и субстрата с удаленной фосфатной группой [30].
Реакция гидролиза первого олигодуплекса отличалась сильным замедлением скорости расщепления немодифицированной Т-цепи и полным блокированием гидролиза A-цепи. Близкая картина наблюдалась и в том случае, когда фосфатная группа была удалена с места разрыва. Следует также отметить, что упомянутые модификации сопровождаются искажением вторичной структуры участка узнаваемого эндонуклеазой, (из-за увеличения конформационной подвижности групп атомов, находящихся вблизи разрыва), что вероятно и вызывает очень сильное ингибирование реакции расщепления цепей. Можно предположить, что дефект структуры в узле —Т—G— приводит к нару-
—Ар С—
шению специфических белок-нуклеиновых контактов с А-цепью. В итоге экспериментов с указанными выше двумя субстратами делается вывод о том, что рестриктаза EcoR II не имеет контакта с фосфатом (5'CCpAGG) A-цепи, а наблюдаемые эффекты объясняются конформационными изменениями субстрата [30].
Фредерих и др. [137] при исследовании комплекса рестриктазы EcoR I с олигонуклеотидом методом рентгеноструктурного анализа обнаружили отклонение от В-формы ДНК, а именно установили, что в области участка узнавания происходит рас-
ширение основного желоба ДНК, а в прилегающих к сайту последовательностях появляются A-подобные структуры двойной спирали. Предполагается, что фермент таким образом стабилизирует переходное состояние, в котором расщепляемая фос-фодиэфирная связь имеет повышенную мобильность. В случае EcoR I обнаружен изгиб между GAA и ТСС [137] участка узнавания (5'GAATTC). Возможно тоже самое происходит и в случае BamH I (5'GGATCC), так как отсутствие в одной цепи фосфатной группы между А и Т, приводящее к разрыву остова, сильно ускоряет гидролиз нативной цепи [45]. Ускорение гидролиза также наблюдается и при отсутствии в одной цепи меж-нуклеотидного фосфата между А и G. Этот эффект, а также аналогичный ему в случае метилфосфатной модификации этого же фосфата, указывает на несущественность этой группы для взаимодействия субстрата с BamH I [419]. Увеличение скорости расщепления нативной цепи отражает участие нарушений структур ДНК, возникающих и при взаимодействии субстрата с рестриктазой, в обеспечении эффективного функционирования фермента [45].
Все представленные выше данные касаются фосфатов только сайта узнавания фермента, хотя имеются данные [127, 137, 233] о влиянии фосфатных групп и за его пределами на взаимодействие с рестриктазами. Это естественным образом вытекает из предыдущей части, где обсуждалась роль участков фланкирующих субстратные последовательности.
Следует отметить, что наличие негидролизуемых аналогов субстрата (с пирофосфатной, фосфоамидной связью и т. д.) позволяет не только исследовать требования к структурным элементам остова, но и изучить процесс образования фермент-суб-стратного комплекса в присутствии кофактора — ионов Mg2+ [10, 13]. Оказывается, что ионы Mg2+ требуются не только для гидролитического акта, но влияют и на процесс связывания субстрата.
7.3.2. Углеводный остаток
Вторичная структура ДНК играет важную роль в узнавании ферментами субстрата. Исследования коротких ДНК-дуплексов, содержащих участки узнавания ряда рестриктаз, методами ЯМР [333] и рентгеноструктурного анализа [137, 386] показали, что информационные параметры отдельных нуклеотидных звеньев варьируют от значений, характерных для В-формы до значений, присущих A-форме двойной спирали. Известно, что некоторые ферменты взаимодействуют с ДНК в различных формах. Например, рестриктазы BssH II и BamH I не расщепляют субстраты в Z-форме [67].
