Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
411]. С целью их выяснения синтезируются олигонуклеотиды, содержащие участок узнавания соответствующей рестриктазы, но с различным его окружением, т. е. различается длина или природа прилегающих нуклеотидных последовательностей. Это позволяет сравнительно легко оценить требования рестриктазы, предъявляемые к субстрату, выполнение которых необходимо для реализации полноценного взаимодействия.
В ранних работах отмечалась устойчивость синтетических олигонуклеотидов, содержащих изолированные участки узнаваемые рядом рестриктаз (EcoR I, Hind III, BamH I), к соответствующему ферменту [4, 146]. В случае рестриктазы EcoR I это было объяснено низкой устойчивостью АТ богатого дуплекса 5'GAATTC [146], однако, этому выводу противоречит способ-3'CTTAAG
ность EcoR I расщеплять более длинные олигонуклеотиды, содержащие ту же последовательность и образующие еще менее устойчивые шестинуклеотидные дуплексы с «липкими» концами [4]. Вероятно рестриктазы способны стабилизировать, а затем расщеплять даже малоустойчивые дуплексы. Устойчивость к действию рестриктаз как изолированных сайтов узнавания, так и некоторых других олигонуклеотидов, содержащих участки узнавания, в первую очередь объясняются тем, что они не удовлетворяют определенным структурным требованиям [3].
Установлено, что для успешного гидролиза олигонуклеотида рестриктазой EcoR II недостаточно окружения из двух нуклеотидов с обеих сторон участка узнавания [407]. Для этого требуется ДНК фрагмент длиной 23—32 пар оснований [10, 409]. Введение в прилегающую последовательность некомплементарной пары АА или АС вместо пары АТ, приводит к ингибированию расщепления субстрата. Изучая структуру олигонуклеотидов, содержащих пару АА [372], методом ЯМР было установлено, что она находится внутри двойной спирали, хотя «стэкинг» — взаимодействие этой пары с соседними частично нарушено и конформация углеводфосфатного остова также изменена. Остатки гетероциклических оснований некомплементарной пары находятся в анти-ориентации относительно дезок-сирибозных остатков, хотя имеют обычную таутомерную форму. Таким образом, ингибирование расщепления субстрата, содержащего АА пару, вызвано прежде всего конформационным фактором. Замена на АС пару вносит в ДНК еще более существенные искажения, чем АА пара. Хотя гетероциклические основания пары А имеют обычную конформацию и таутомерную форму, они, возможно, выходят за пределы двойной спирали. Соответственно, большее нарушение структуры ДНК (замена на АС пару) соответствует более сильному замедлению (60 раз) расщепления субстрата рестриктазой EcoR II по сравнению с нативным дуплексом (при замене на АА пару гидролиз замедляется в 10 раз) [372]. Как видно, для эффективного действия фермента необходимо наличие правильной структуры нуклеотидной пары, примыкающей к сайту узнавания. Наблюдаемая чувствительность рестриктазы EcoR II к структурным аномалиям во фланирующей последовательности может быть следствием как изменения самой этой последовательности, так и передачи структурного изменения в участок узнавания [12].
В случае рестриктазы EcoR I введение даже двух АС пар рядом с участком узнавания не приводит к столь сильному как в случае EcoR II замедлению гидролиза (только в 3 раза). Расщепление ускоряется, если у сайта расположены АТ пары оснований и ингибируется — если пары CG [224]. Эта рестриктаза удовлетворяется минимальным числом нуклеотидов (одним), примыкающим к участку узнавания, а для рест-
риктазы Hind III необходимы два витка спирали [4]. Крп I требует фланкирования обеих цепей с 5'-конца и хотя бы одной цепи с З'-конца [3].
Обнаружено, что рестриктаза Msp I расщепляет быстрее цепи богатые пуринами. Это объясняется предположением, что пуриновые нуклеотиды создают гидрофобное окружение, важное для полноценного взаимодействия с рестриктазой, или предопределяют молекулярную структуру участка узнавания через «стэкинг» взаимодействие оснований [411]. Рестриктаза Hpa I расщепляет преимущественно цепи находящиеся в пиримидиновом окружении (в 3—4 раза быстрее, чем в пуриновом), а Мпо I не делает предпочтения ни для одного типа окружения цепей [73].
Обобщая можно сказать, что последовательности нуклеотидов, окружающие участки узнавания, через свою гидрофобность или гидрофильность или своим пространственным расположением может влиять на формирование фермент-субстратного комплекса, в котором происходит разрыв фосфодиэфирной связи.
7.3. Взаимодействие рестриктаз с углеводфосфатным остовом участка узнавания
Известно, что углеводфосфатный остов во многом определяет конформацию и физико-химические свойства нуклеиновых кислот. Естественно ожидать, что удаление или замена отдельных структурных элементов углеводного остова будет приводить к измененной конформационной подвижности его химических группировок и тем самым нарушать каноническую конформацию нуклеотидной последовательности. Таким образом, осуществляя модификации остова, можно оценить взаимосвязь между конформацией ДНК и функционированием рестриктаз. С целью выявления значимости отдельных структурных элементов углеводфосфатного остова участка узнавания были изучены субстратные свойства олигодуплексов с модифицированными фосфодиэфирными связями в виде разрыва фосфодиэфирных связей [30, 407]; 2) или отсутствия фосфатной группы [30, 408, 419] в олигонуклеотидной цепи, а также с модифицированным углеводным остатком [12, 282].
