Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
ляется довольно эффективно, а модифицированная — лишь незначительно.
Для полноты характеристики этих рестриктаз надо отметить, .что в отличие от EcoR II, Mva I отличает аденин от тимина в узнаваемой последовательности [29].
Удаление одного или нескольких нуклеотидов одной цепи в левой от центра симметрии половине узнаваемого участка рестриктазы BamH I (5’G*GATCC) значительно снижает эффективность расщепления нативной цепи, так как видимо нарушается целостность двухспиральной структуры гидролизуемой половины сайта [45]. Эта рестриктаза отличается интересным поведением, которое выявили результаты эксперимента с синтетическим олигонуклеотидом dTCCAGATCTGGA, содержащим на концах половинки узнаваемого участка (выделено). Оказывается, RBamH I способна взаимодействовать с двумя дуплексными субстратами, стягивая их в единый комплеск, близкий по структуре к ковалентно связанным полинуклеотидным цепям. Другим примером такого поведения служит ДНК-лига-за фага Т4, способная к сшиванию двухцепочечных фрагментов ДНК с «тупыми» концами [131]. Молекула рестриктазы BabH I состоит из двух одинаковых субъединиц, в каждой из которых имеются связывающий и гидролитический центры [355]. Можно предположить, что связывающие центры в каждой из субъединиц взаимодействуют с «разъединенным» участком узнавания и соединяют его в структуру, подобную нативной, после чего вступает в действие гидролитический центр. Специфичность действия последнего существенно ниже специфичности связывания, так как гидролиз идет не только в каноническом месте (5’G+GATCC), но и рядом с ним. Такое расщепление может быть объяснено своеобразным люфтом между концами обеих молекул олигонуклеотидов, жестко не связаных ковалентными связями, а удерживаемых друг относительно друга за счет взаимодействия с ферментом, в котором, область межсубъединич-ного контакта может в определенных пределах деформироваться благодаря конформационной гибкости, свойственной всем белковым молекулам [20].
В рамках этого предположения показана допустимость пробелов в участке узнаваемом рестриктазой RBamH I, а именно — отсутствие аденина в одной или в обеих цепях, не исключающих его расщепления, [20].
Как следует из рассмотренной информации, в результате исследований взаимодействия рестриктаз с модифицированными субстратами накоплен большой экспериментальный материал, интерпретация которого зачастую отличается спекулятивностью и неоднозначностью.
Более прямым методом локализации специфических контактов аминокислотных остатков, участвующих во взаимодействии с ДНК, является фотохимическое сшивание белка с ана-
логами ДНК, содержащими 5-бромурацил [102, 103]. Этот метод был использован [103] для установления участка связывания рестриктаз EcoR I и EcoR V с синтетическими олигонуклеотид-ными субстратами, содержащими указанную модификацию. В последние годы метод фотохимического сшивания ДНК с белком получил развитие, так как было показано [104, 128], что при использовании лазерного излучения происходит сшивание белка с немодифицированными основаниями ДНК. Однако, этот метод находится на стадии апробации и пока не может конкурировать с таким методом определения специфических контактов ДНК с белком, каким является рентгеноструктурный анализ — на сегодняшний день, самый информативный метод исследования тонкостей белок-нуклеинового узнавания.
8. РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСА РЕСТРИКТАЗЫ EcoRI С СУБСТРАТОМ
Наиболее полное представление о природе взаимодействия рестрикционных эндонуклеаз со специфической нуклеотидной последовательностью было получено Розенбергом с сотр. [137, 250], которые впервые провели рентгеноструктурные исследования комплекса рестриктазы EcoR I с синтетическим 13-ти членным олигонуклеотидным дуплексом, содержащим последовательность 5'GAATTC, и имеющим следующее строение: 012345678 9 10 11 12
TpCpGpCpGpApApTpTpCpGpCpG (показана только одна цепь, участок узнавания рестриктазы EcoR I подчеркнут). В результате этих исследований была установлена трехмерная структура комплекса рестриктазы EcoR I с синтетическим олигонуклеотидом с разрешением в 3 А. Данные рентгеноструктурного анализа подтвердили модель симметричного узнавания [233] специфической нуклеотидной последовательности рестриктазой EcoR I, а также предположения, полученные при исследованиях на модифицированных субстратах (см. разд. 7), о доминирующей роли взаимодействий в главном желобе ДНК в процессе узнавания специфической нуклеотидной последовательности белком. В фер-мент-субстратном комплексе две субъединицы EcoR I образуют симметричную структуру, содержащую ДНК частично «погруженную» в белок с одной стороны между субъединицами, при этом главный желоб ДНК полностью контактирует с белком, а минорный желоб экспонирован в растворитель.
В результате рентгеноструктурных исследований были получены новые данные относительно структуры ДНК в комплексе с ферментом. Во-первых, было показано, что структура ДНК отклоняется от классической В-структуры ДНК. Установлено, что в комплексе с ферментом происходит частичное
