Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Янулайтис А.А. -> "Биотехнология. Том 17" -> 51

Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.

Янулайтис А.А. Биотехнология. Том 17 — Москва, 1989. — 204 c.
Скачать (прямая ссылка): fermentiserekteciiiihpremenenie1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 45 46 47 48 49 50 < 51 > 52 53 54 55 56 57 .. 107 >> Следующая

На основе механизма узнавания специфической последовательности ДНК рестриктазой EcoR I посредством водородных связей, удалось объяснить «релаксированную» специфичность рестриктазы EcoR I и иерархию «вырожденных» последовательностей, служащих узнаваемым участком, в отношении скорости их расщепления. Замещение любого из оснований в канонической EcoR I последовательности неизбежно приводит к уменьшению числа водородных связей с ферментом. В случае проявления релаксированной активности рестриктазы разные последовательности, являющиеся производными канонической,
расщепляются с неодинаковой скоростью [233]. Было установлено, что существует следующая градация (иерархия) скоростей гидролиза субстрата в зависимости от природы основания в первом положении последовательности 5'GAATTC: G^A> >Т>С (5'GAATCC расщепляется быстрее чем 5'АААТТС и т. д.). Эта закономерность находит свое объяснение в зависимости между замещениями в канонической последовательности и снижением числа водородных связей с ферментом. Замещение аденина на гуанин приводит к исчезновению одной водородной связи То же самое наблюдается в случае замены гуанина на тимин. Поэтому последовательности 5'АААТТС и 5'ТААТТС смогут образовать с белком не более 11 водородных связей. Цитозин вообще не способен образовывать водородные связи. Поэтому последовательность 5'СААТТС образует с белком только 10 сайтспецифических водородных связей.
Учитывая быстрый прогресс в конструировании продуцентов рестриктаз методами генной инженерии, использование которых позволяет выделить необходимые количества целевого белка и установить его первичную структуру, а также большой интерес к исследованию механизмов специфического белок-нуклеинового взаимодействия, следует предположить, что в ближайшее время появятся новые работы, посвященные изучению обсуждаемого вопроса. В результате будет получен ответ на вопрос о существовании или отсутствии универсального специфического кода узнавания (взаимодействия) между белком и ДНК. Выявление такого кода способствовало бы конструированию рестриктаз заданной специфичности методами белковой инженерии.
9. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА ФЕРМЕНТОВ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ
Методом генетического анализа в исследованных немногочисленных случаях было установлено, что система хозяйской специфичности в случае ферментов II типа контролируется двумя (г и ш) генами [64, 413]. Также в этих опытах была показана нежизнеспособность штаммов с генотипом r+m~ [64, 413], что вполне понятно учитывая функцию метилазного компонента в системе двух сопряженных ферментов. На этом же этапе исследований было установлено, что гены ферментов рестрикции-модификации могут быть локализованы на плазмидах [167, 389]. В настоящее время предполагается, что некоторые гены rm расположены в бактериальных хромосомах [180, 194, 306, 350, 363, 389], хотя строго говоря этот вывод экспериментально подтвержден только в случае BsuR I [375]. Имеется пример фаговой локализации генов, контролирующих структуру ферментов RMEcoP I, относящихся к Ill-ему типу [184, 351]. В от-
ношении ферментов II типа такие данные получены в случае ферментов, кодируемых ДНК вирусов, размножающихся в эукариотических клетках [271].
Бактериофаги SPR, ФЗТ, Qll Bacillus subtilis содержат гены метилаз не входящих в системы R—М и модифицирующих одновременно два или три типа специфических нуклеотидных последовательностей ДНК. Показано, что MBsuSPR модифицирует цитозин в трех последовательностях— 5'GGCC; 5'ССт GG; 5'CCGG, а МВэиФЗТ и MBsu Qll в двух последовательностях— 5'GGLC; 5'GCNGC и 5'GGCC; 5'GAGCTC соответственно [74, 154, 155, 195, 280, 376]. Эти метилазы могут выполнять антирестрикционную функцию, так как последовательности, модифицируемые этими метилазами, входят в спектр последовательностей узнаваемых рестриктазами, выделенными из разных штаммов Bacillus subtilis.
В клетках Е. coli также имеются две метилазы, не входящие в состав систем рестрикции — модификации. Метилаза Eco dam модифицирует аденин в последовательности 5'GATC. Ее ген локализован в хромосоме на 65 минуте, а ген метилазы Eco dcm (специфичность 5'СС (A/T) GG), локализован на 37 минуте [241]. Есть данные, что эти ферменты в бактериальной клетке выполняют полифункциональную роль [242, 330].
Следует отметить, что исследования систем RM II типа методами генанализа являются немногочисленными. Это вполне объяснимо, учитывая тот факт, что подавляющее большинство продуцентов рестриктаз относятся к таксонам, которые пока недоступны для применения генетических методов исследования. Поэтому в этом случае единственным выходом из создавшейся ситуации является применение молекулярно-генетического метода — метода генной инженерии. Учитывая большие потенциальные возможности этой методологии, в последнее время она стала основным подходом при исследовании таких вопросов как структура и структурная организация, а также регуляция экспрессии генов гш. Большой интерес представляют данные о первичной структуре, наличие которых способствует решению таких фундаментальных задач, как механизмы высокоспецифического белок-нуклеинового взаимодействия и эволюции генов рестрикции-модификации. В прикладном аспекте клонирование генов гш и исследование их структуры является базой для создания высокоэффективных продуцентов дефицитных ферментов.
Предыдущая << 1 .. 45 46 47 48 49 50 < 51 > 52 53 54 55 56 57 .. 107 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed