Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
расплетение спирали ДНК, относительно центральной пары оснований А6Т7 в олигонуклеотиде. В результате такого расплетения спирали ДНК происходит расширение главного желоба, что, по-видимому, облегчает доступ определенным участком белка для взаимодействия с основаниями ДНК. В результате частичного расплетения ДНК происходят не только изменения в остове ДНК, приводящие к изменению размеров главного желоба, но и изменения расстояний между соседними нуклеотидными основаниями. Установлено, что уменьшается расстояние между соседними нуклеотидными основаниями А5 и А6. Во-вторых, было показано, что наряду с частичным расплетением ДНК относительно центральной пары нуклеотидов А6Т7, происходит изгиб спирали в районе нуклеотида G4. Угол изгиба при этом составляет от 20° до 40°. Таким образом, было установлено, что при взаимодействии ДНК с EcoR I, происходят значительные изменения конформации ДНК.
В результате обсуждаемых исследований также была установлена трехмерная структура белка и выявлены структурные его детерминанты, взаимодействующие с ДНК. Каждая субъединица фермента представляет собой отдельный домен, состоящий из 5 [5-структур, окруженных а-спиралями. Эти а-спи-рали ориентированы в пространстве таким образом, что их N-концы вклиниваются в главный желоб ДНК. Аминокислотные остатки, которые взаимодействуют с нуклеотидными основаниями, расположены именно на N-конце а-спиралей или рядом с ним. Первые 14 N-концевых аминокислотных остатка белка образуют петлю, которая «охватывает» ДНК в комплексе с ферментом.
Исследование структуры комплекса ДНК с EcoR I позволило также выявить возможную каталитическую щель, однако, расположение функциональных групп в активном центре белка установить не удалось, так как исследованный комплекс ДНК с EcoR I, образовавшийся в отсутствии ионов Mg2+, не является продуктивным. Расщепление фосфодиэфирной связи происходит лишь в присутствии Mg2+ и поэтому полная структура каталитического центра формируется в результате комплексообра-зования с этими ионами.
Несмотря на то, что проведенные исследования не позволили выявить структуру активного центра молекулы фермента, в результате все же был раскрыт механизм узнавания специфической нуклеотидной последовательности ДНК, обуславливающий уникальную специфичность рестрикционной эндонуклеазы. Установлено, что в основе процесса узнавания лежит взаимодействие между определенными группами белка и нуклеотидными основаниями, расположенными в главном желобе. Показано, что между аминокислотными остатками Glu144, Arg145, и Arg200 и пуриновыми основаниями гексануклеотида 5'GAATTC образуется ряд водородных связей, обеспечивающих специфическое
взаимодействие ДНК и фермента (ом. рис. 1). Аминокислотные остатки, учавствующие в образовании водородных связей с нуклеотидными основаниями, расположены на симметричных субъединицах рестриктазы EcoR I таким образом, что Arg200 локализован на внешней, a Arg145 и Glu144 на внутренних а-спира-лях, проникающих в главный желоб ДНК. Аминокислотный остаток Arg200, расположенный на внешней а-спирали каждой
Рис. 1. Схематическое изображение водородных связей, образующихся при взаимодействии рестриктазы EcoR I с основаниями узнаваемой последовательности нуклеотидов
из субъединиц, взаимодействует с гуаниновым основанием, образуя 2 водородные связи, а аминокислотные остатки Arg145 и Glu144 этой же субъединицы образуют 4 водородные связи с адениновыми основаниями олигонуклеотида 5'ААТТ. Аминокис-
лоты Arg145 и Glu144 одной субъединицы взаимодействуют с парами соседних адениновых оснований локализованных на разных нитях ДНК (см. рис. 1). Следует отметить, что аминокислотные остатки Arg145 и Glu144 образуют поперечные водородные связи с соседними аденинами как бы «сшивая» их при помощи водородных связей.
Атд ZOOfi
Arg та
t Р-----------W.7 N.8^ О 6lu144fi
АгдгООа
З'ТТАА
Таким образом аминокислоты отдельно взятой субъединицы, участвующие в «узнавании», образуют водородные связи с основаниями согласно схеме представленной ниже (это упрощенный вариант схемы, рис. 1):
« 145
Агдл
“IT
е 1-А. т т С
го ИЮ __ W
веиа 1---г
с т т 1 f л
Аг9а*
(—) а субъединица; fi Субъадиница.
Таким образом между аминокислотными остатками Arg20®, Arg145 и Glu144 одной субъединицы и 5-тью нунклеотидными основаниями участка узнавания, образуются 6 водородных связей. Аналогичные взаимодействия симметричной субъединицы с субстратом приводит к образованию еще 6 водородных связей. Реализация обсуждаемых водородных связей с ДНК в обычной В-конформации невозможно, однако, как уже отмечалось выше„ в результате взаимодействия ДНК с белком, происходит частичное расплетение нитей ДНК, приводящее к сближению нуклеотидных оснований АА и ТТ, что и приводит к появлению-возможности образования поперечных водородных связей с соседними аденинами. Таким образом, между аминокислотными остатками Arg200, Arg145 и Glu144, расположенных на обеих субъединицах рестриктазы, и гексануклеотидов 5'GAATTC образуется 12 водородных связей, которые обеспечивают специфичность связывания рестриктазы EcoR I с канонической нуклеотидной последовательностью. Следует отметить, что в этом случае наблюдается «насыщение по водородным связям» между олигонуклеотидом 5'GAATTC и аминокислотными остатками, участвующими в узнавании.
