Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Для объяснения отсутствия расщепления олигонуклеотида рестриктазой EcoR I, в котором вместо внешнего Т находится 5'G*AATU С привлекаются данные о возможном изменении З'С UTAA^G
конформации модифицированного субстрата. Результаты ЯМР анализа [123] самокомплементарного олигонуклеотида 5'CTACGUAG, содержащего А—U пары оснований свидетель-3'GAUGCATC
ствуют, что N-гликозидные связи этих пар и А—Т пар прилегающих с З'-конца, являются искаженными [123]. Возможно, что такие искажения и влияют на взаимодействие рестриктазы EcoR I с вышеуказанным модифицированным субстратом. Обращает на себя внимание тот факт, что замена Т на U про-
ведена в таком положении сайта, где находится расщепляемая фосфодиэфирная связь.
В случае изучения рестриктазы Нра I (5'GTT*AAC) заменам на U или на 5BrU подвергался Т, находящийся около расщепляемой фосфодиэфирной связи, [127]. Первая замена блокировала гидролиз олигонуклеотида, а вторая — приводила к появлению незначительного количества продуктов рестрикции. Из этого был сделан вывод, что 5-СН3 группа тимина участвует в образовании гидрофобного контакта с ферментом-Способность рестриктаз Нра I и EcoR I расщеплять Хромированный субстрат указывает, что атом брома может компенсировать потерю 5-СНз группы путем вступления в прямой контакт с ферментом, так как Ван-дер-вальсовый радиус атома брома близок радиусу метильной группы, только он является более электроотрицательным. Наличие атома Вг в пиримидиновом кольце меняет распределение электронов и таким образом может влиять на взаимодействие пиримидина с соседними основаниями или белком [265].
Имеется публикация [377], авторы которой показали, что замещение обоих Т на U в сайте REcoR I (5'GAATTC) не влияет на скорость его расщепления. Строго говоря нельзя утверждать, что полученные результаты противоречат рассмотренным выше, т. к. в этом случае Т на U в сайте REcoR I замещались по одиночке [90]. Таким образом сравниваемые данные получены с разными субстратами. Однако, отсутствие эффекта замещения обоих Т на U на расщепление субстрата ферментом как бы указывает, что 5-СНз группы Т являются несущественными для контакта с REcoR I. Авторы все-таки на основе данных о том, что замещение наружного Т на 5BrU дает ускорение реакции расщепления, делают вывод о том, что метальные группы контактируют с REcoR I [377].
Для рестриктазы EcoR II (5'CC(T/A)GG) тоже подтверждено наличие контакта с метильной группой центрального Т (замена его на U [410] и 5flU [12] замедляет, а наличие 5BrU [19]—ускоряет гидролиз (по сравнению с каноническим олигонуклеотидом). Следует отметить, что модификация одной цепи влияет на расщепление обеих цепей.
По-видимому, в случае EcoR II, фермент вступает в контакт с атомом фтора, но этот контакт существенно отличается от контакта с метильной группой [308]. С другой стороны субстрат, содержащий 5flU [215], нарушает конформацию олигонуклеотида и оказывает дестабилизирующее влияние на 5flLJ — А пару оснований [116].
Рестриктаза Mva I (5'CC*(A/T)GG) не имеет контакта с 5-СНз группой центрального тимина. Замещение ее на Н или F атомы [215] не влияет на расщепление. Замена на атом брома [29] снижает скорость расщепления ДНК-дуплекса в 1,5 раза, по сравнению с немодифицированным. Ингибирующий эф-
фект, по-видимому, является результатом стерических препятствий атома брома, расположенного рядом с местом расщепления.
7.1.3. Цитозин
С целью выявления возможных контактов эндонуклеаз рестрикции с атомом водорода в С5-положении цитозина (расположен в большом желобе ДНК) изучалось их взаимодействие с субстратами, содержащими метальную группу (ш5С) [12, 19, 90, 136, 284, 377] или атом брома — 5ВгС — [19] в участках узнавания.
Недавнее открытие нового варианта метилированного С — т4С (цитозин метилирован по 4-амино группе (4-ЫНг) [103,
128] стимулировало появление работ, посвященных выяснению роли 4-NH2 группы цитозина, находящейся как и т5С в большом желобе, на взаимодействие ферментов с ДНК.
Относительно рестриктазы EcoR I (5'GAATTC) имеются противоречивые данные о роли 5-Н атома во взаимодействии фермента с ДНК-дуплексами. Одни исследователи делают вывод о том, что он че играет никакой роли (скорость расщепления субстрата, содержащего т5С, не меняется, по сравнению с каноническим) [377]. Бренан и др. [90] получили противоположный результат (EcoR I не расщепляет олигонуклеотиды, в которых цитозин заменен на ш5С или 5ВгС) и объясняют его тем, что фермент находится в непосредственной близости с С5 атомом углерода. Отсутствие расщепления таких субстратов объясняется интерференцией этих групп взаимодействию рестриктазы с группами и атомами соседних оснований, а также изменением конформации ДНК в участке узнавания. По поводу второго лредположения имеются подтверждающие данные рентгеноструктурного исследования кристалла самокомплементарного додекануклеотида, содержащего т5С и 5ВгС в участке узнавания EcoR I [136]. Возможно, что то же самое происходит и со структурой модифицированного субстрата в растворе.
