Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
На примере модификации углеводных остатков участка
узнавания, изменяющих вторичную структуру ДНК, была сделана попытка рассмотреть влияние этого фактора на взаимодействие с ферментами.
Согласно данным Виноградовой с соавт. [12], введение рибо-уридина (rU) в участок узнавания рестриктаз-изошизомеров EcoR II и Mva I (5’СС(A/T)GG) и Sso II (5’CCNGG) вместо dT, сопровождается локальным искажением В-формы двойной спирали, обусловленным появлением домена с конформацией подобной A-форме. Такая замена вызывает замедление ферментативной реакции катализируемой EcoR II. В случае Sso II [11] наблюдается обратный эффект — ускорение расщепления модифицированного субстрата. Возможно, в комплексе Sso II с нативным субстратом конформация вырожденной пары (А/Т) участка узнавая соответствует A-форме двойной спирали.
Может возникнуть вопрос — не обусловлено ли замедление скорости гидролиза rU-субстрата рестриктазой EcoR II отсутствием 5-метильной группы тимина в нем. Это исключается, поскольку при замене dT на dU скорость реакции уменьшается только в 2 раза [410], а в обсуждаемом случае она снизилась в 10 раз.
Для рестриктазы Mva I эта модификация, а следовательно и искажение формы спирали узнаваемого участка, не влияет на расщепление Т цепи, а интактная — А цепь расщепляется лишь незначительно хуже, что обясняется важностью контактов для одной субъединицы фермента не только со своей, но и с противоположной цепью [29].
Отношение рестриктазы EcoR I (5’GAATTC) к модификациям углеводных остатков было исследовано путем введения вместо внешнего dA в участке узнавания 9-|3-0-арабинозиладенина (аА), аденозина (гА), 2’-дезокси-2’-фтораденозин (ИА), а вместо dG-2’-Ae30KCH-2’^T0pryaH03HHa (flG). Все перечисленные
модификации за одним исключением ингибировали расщепление ферментом соответствующих дуплексов. Исключение относится к flG замене, которая дала увеличение скорости гидролиза [282]. Изменение скорости ферментативной реакции опять можно объяснить появлением доменов A-формы обусловленных наличием rA, flA, аА [283], flG [282], в которых углеводный остаток аденозина или гуанозина находится в З’-эндо форме, в отличие от 2’-эндо формы, присущей дезоксиаденозину или дезоксигуанозину. Делается предположение, что замена
G на flG благоприятствует фермент-субстратному взаимодействию [282].
Как видно, для активности большинства рестриктаз требуется правильная В-форма ДНК. Любое искажение ее структуры приводит к изменению активности ферментов, на что например, указывает отсутствие расщепления рестриктазой
EcoR I рибооктамера 5’GGAAUUCC, которому присуща А-форма [282].
7.4. Некоторые взаимодействия рестиктаз с отдельным нуклеотидом (или его звеном) участка узнавания
Каждый нуклеотид участка, узнаваемого соответствующей рестриктазой, играет свою и только ему присущую роль в обеспечении эффективного взаимодействия фермента с ДНК и ее расщепления. Были проведены эксперименты с целью установить функцию отдельного нуклеотида (dNp) или всего звена (pdNp) участка узнавания способом его удаления (с сохранением или отсутствием ковалентной непрерывности фосфоди-эфирной связи) [20, 30, 45] или замены на другой нуклеотид, содержащий некомплементарное основание [233], в вышеуказанных процессах.
Например, замена центральной пары оснований участка узнавания рестриктаз EcoR II, Mva I и Sso II (5’CC(T/A)GG) AT на AA или TT вызывает замедление реакций катализируемой EcoR II [408] и Sso II [29] (особенно в случае замены на АА пару) и полное блокирование (при замене на АА) гидролиза измененного субстрата рестриктазой Mva I [29]. Изменение в скорости гидролиза возможно из-за локального искажения конфигурации двойной спирали участка узнавания, которое наблюдается с появлением некомплементарной пары оснований. Этот эффект выражен сильнее в случае контакта двух относительно больших остатков аденина. То же наблюдается и при замене внутренней пары CG на GG в участке узнаваемом Mva I [29] — модифицированная цепь не гидролизуется, а интактная — расщепляется с низкой эффективностью.
Модификация участка, узнаваемого этими же ферментами, состоящая в исключении dA или dT звена с нарушением или сохранением в цепи непрерывности фосфодиэфирных связей приводит к полному ингибированию расщепления обеих цепей рестриктазами Mva I и EcoR II [30]. Таким образом, наличие не-модифицированного центрального нуклеотидного звена pdTp или pdAp в каждой из цепей участка, узнаваемого EcoR II, необходимо для продуктивного взаимодействия фермента с субстратом. Основываясь на данных предыдущего раздела о роли фосфатных групп узнаваемого участка рестриктазы Mva I, более точно определяется звено, имеющее существенное влияние при взаимодействии эндонуклеазы с ДНК — это не pdAp или pdTp, a dAp или dTp. Обе упомянутые рестриктазы имеют контакт с остатком dA участка узнавания, который реализуется для различных целей — RMva I его использует только для расщепления А цепи, a EcoR II — для гидролиза обеих цепей [29]. Этот вывод делается на основе данных о действии RMva I и EcoR II на субстраты, в которых звено dA заменено на триметиленовый мостик. В случае REcoR II гидролиз отсутствует, а в случае RMva I, немодифицированная Т цепь расщеп-
